我撰写了一篇关于放疗联合免疫检查点抑制剂治疗结直肠癌作用机制的科学文章，准备翻译后向影响因子2分左右...

我撰写了一篇关于放疗联合免疫检查点抑制剂治疗结直肠癌作用机制的科学文章，准备翻译后向影响因子2分左右的杂志投稿，请为我检查这篇文章有无明显的科学错误和表达不当的情况，不需要精确到具体的用词和语法，因为后续还需要翻译和润色。
正文如下：
Combining radiation and anti-PD-L1 enhances the antitumor activity in colorectal cancer by activating STAT1 signaling pathway
Xiao Yang 1,2, Dandan Gao 3, Heng Zhang 4, Wanjun Sun 4, Huaqing Wang 4,5,6, Siwei Zhu 1, Hui Wang 1,4
1 Nankai University, Tianjin 300193, China
2 Department two of Gastroenterology, Tianjin Union Medical Center, Tianjin, 300121, China
3 Tianjin University of Traditional Chinese Medicine, Tianjin 301600, China
4 Department of Oncology, Tianjin Union Medical Center, Tianjin, 300121, China
5 The Institute of Translational Medicine, Tianjin Union Medical Center, Tianjin 300121, China
6 Tianjin Cancer Institute of Integrative Traditional Chinese and Western Medicine, Tianjin, 300121, China
Correspondence should be addressed to Hui Wang; [email protected]
Abstract
结直肠癌是中国的高发肿瘤之一，外科手术切除是主要的治疗方法，对于失去手术机会或新辅助治疗的病人，有放疗、化疗、靶向治疗、免疫治疗等方案。放射联合免疫治疗是新兴的抗肿瘤方案，已有初步的临床研究证实了该治疗的有效性。然而，放疗联合免疫治疗的协同作用机制及其对肿瘤微环境的影响仍有待进一步研究。在这项研究中，我们使用GEO数据库中结直肠癌样本GSE179351，进行差异基因分析、功能富集分析和免疫浸润分析。为了验证生物信息学分析结果，我们使用ct26.wt小鼠结肠癌细胞系，将其种植于免疫功能健全的Balb/c小鼠，建立皮下荷瘤动物模型，给予单独治疗或放射联合免疫检查点抑制剂治疗，探究不同的治疗方案对结直肠癌的抑制作用和治疗安全性。收获肿瘤后，我们通过免疫组化和流式细胞仪检测肿瘤微环境和外周免疫反应，使用ELISA检测炎性因子IFN-γ水平。在后续的体外实验中，我们使用ct26.wt和mc38小鼠结肠癌细胞系搭建细胞实验模型，使用WB检测IFN-γ对JAK-STAT信号通路蛋白激活状态的影响。生物信息学分析显示，放疗联合免疫检查点抑制剂治疗可能通过增强CD8+ T细胞的浸润和活性，从而激活和维持IFN-γ的功能，并导致JAK-STAT信号通路激活并促进肿瘤细胞的凋亡。体内实验结果显示放射联合免疫检查点抑制剂更有效地抑制肿瘤生长，并且在肿瘤微环境中诱导了更多的CD8阳性T细胞浸润，同时，在微环境和外周免疫中，联合治疗诱导了更高水平的IFN-γ。体外实验证实高水平的IFN-γ激活了肿瘤细胞的JAK-STAT信号通路，增加了凋亡蛋白的表达。我们的研究表明放射联合免疫检查点抑制剂通过改变肿瘤微环境，促进肿瘤细胞凋亡，对pMMR/MSS型结直肠癌患者具有良好的治疗前景。
背景
结直肠癌（colorectal cancer, CRC）是全球高发的恶性肿瘤之一。据统计，2020年全球新发结直肠癌病例约193万，死亡约93万例，占所有癌症病例和死亡的近1/10，发病率居第三，死亡率居第二1。近些年结直肠癌发病率呈上升趋势，在中国，结直肠癌的发病率位居第三，仅次于肺癌和胃癌2。约20%的结直肠癌患者在初诊时即有远处转移，这一比例过去20年几乎没有改变。传统治疗手段包括手术、化疗和放疗，但对于中晚期患者，5年生存率仍然不理想3。
放疗是结直肠癌的主要治疗手段之一，放射生物学相关研究表明，电离辐射（ionizing radiation，IR）可在细胞中激发活性氧持续损伤DNA，造成癌细胞DNA损伤而导致细胞凋亡、衰老或失去增殖能力。新辅助放疗可以减小肿瘤体积，提高手术切除率，并降低局部复发风险4。电离辐射可诱导肿瘤细胞的免疫原性死亡，释放肿瘤相关抗原并促进树突状细胞（DC）的募集和激活，从而增强T细胞介导的免疫应答5。此外，放疗还可上调肿瘤细胞表面的主要组织相容性复合物（MHC）和死亡信号，从而提高肿瘤对免疫系统的可见性。放疗诱导的炎症反应包括多种细胞因子的分泌，有利于将“冷肿瘤”转化为“热肿瘤”，使更多免疫细胞浸润肿瘤部位6。然而，放疗亦可能上调免疫抑制分子（如PD-L1、TGF-β等）或招募调节性T细胞和髓源性抑制细胞，这在一定程度上限制了放疗的抗肿瘤免疫效果。因此，单纯放疗诱发远隔效应的临床案例较为少见，需要与全身免疫激活相结合才能充分发挥其潜力。据本中心统计，术前同步放化疗病理学完全消退率约为9%，放疗敏感性仍需要进一步提高，因此设计联合治疗方案提高放疗敏感性具有重要意义。
免疫检查点抑制剂（immune checkpoint inhibitor，ICI）是一类针对肿瘤免疫逃逸机制的药物，通过激活患者自身的免疫系统来攻击和清除肿瘤细胞。免疫检查点抑制剂主要的作用机制是阻断肿瘤细胞或免疫细胞上的免疫抑制信号通路，如PD-1/PD-L1和CTLA-4，从而增强T细胞对肿瘤的识别和杀伤能力7。目前免疫检查点抑制剂已经逐步应用于临床，临床医师需要根据患者的错配修复/微卫星不稳定性（MMR/MSI）状态制定术前新辅助治疗策略，MMR缺陷/高度MSI（dMMR/MSI-H）者，抗PD-1单抗帕博利珠单抗一线治疗显示出显著优于化疗的无进展生存期8-10。然而，大约95%的晚期CRC患者属于错配修复完整或微卫星稳定（pMMR/MSS）型，对ICIs单药疗效甚微，客观缓解率几乎为07。如何提高MSS型结直肠癌对免疫治疗的响应是当前研究的重点和难点。
为克服MSS结直肠癌的原发耐受，研究者们探索了ICIs与其他治疗手段的联合策略，包括联合化疗、抗血管生成药物、靶向治疗以及放射治疗等5。其中，放射联合免疫治疗是新兴的抗肿瘤方案，已有初步的临床研究证实了该治疗的有效性11。一方面，ICIs如抗PD-1/PD-L1抗体可解除肿瘤对T细胞的免疫抑制，提高T细胞的数量和功能；另一方面，放疗可提供肿瘤抗原和促进炎症微环境，使得更多T细胞进入并识别肿瘤。联合治疗有望扩大免疫治疗的获益人群，使部分对ICIs初始耐受的患者转变为敏感。例如，在结直肠癌动物模型中，放疗联合PD-1阻断可增加肿瘤浸润淋巴细胞并减少抑制性免疫细胞，实现对原发灶和远处转移灶的同步控制5。临床前研究提示，同时抑制多个免疫调控途径（如联合CTLA-4和PD-1抑制剂）并配合局部放疗，可进一步增强抗肿瘤免疫效果6。两种治疗方法发挥协同效应增强免疫系统对肿瘤的反应性和杀伤力，提高治疗成功率，这种组合治疗策略已在多种肿瘤类型中显示出潜在的治疗效果，并成为肿瘤治疗领域的研究热点之一12。然而，目前放疗联合免疫治疗的协同作用机制及其对肿瘤微环境的影响仍有待进一步研究。
肿瘤微环境（tumor microenvironment，TME）是指癌细胞周围的组织环境，包括癌细胞、免疫细胞、血管和其他细胞成分。这个微环境对于肿瘤的发展和治疗反应起着重要的作用。在肿瘤微环境中，免疫细胞起着关键的作用。正常情况下，免疫细胞可以识别和清除异常细胞，抑制肿瘤的生长。一方面，肿瘤细胞可以通过多种机制逃避免疫系统的攻击，形成免疫逃逸现象13，另一方面，微环境中的多种信号因子可以影响肿瘤细胞内部多条信号通路的表达，对肿瘤的增殖、代谢、凋亡造成影响。本研究将从肿瘤微环境角度出发探索放射治疗联合免疫检查点抑制剂在结直肠癌中的作用机制。JAK/STAT通路在肿瘤细胞的生长、存活、增殖以及凋亡（程序性细胞死亡）中发挥着重要的调节作用，其中，STAT1通常在细胞受到干扰素（如IFN-γ）或其他细胞因子的刺激时被激活，它在某些情况下促进肿瘤细胞的凋亡14。我们尝试检测联合治疗对该通路的影响，以探究联合治疗的抗肿瘤机制。
综上所述，我们检索公共数据库进行生物信息分析，随后建立荷瘤动物模型，验证放射联合免疫检查点抑制剂对结肠癌的抑制作用，检测干预后微环境中免疫细胞、炎性因子水平，结合体外细胞实验，观察肿瘤细胞内部相关信号通路的表达情况，探索放射免疫联合治疗机制。尽管肿瘤微环境的复杂性使得肿瘤的放射免疫治疗面临挑战，我们的研究将深入探索干预后肿瘤微环境的变化和抗肿瘤机制，为结直肠腺癌的放射免疫联合治疗提供理论依据，使更多病人从中获益。
材料和方法
小鼠和细胞系. 雄性6周龄Balb/c小鼠购买自斯贝福生物技术有限公司（中国，北京），所有小鼠于中国医学科学院放射医学研究所动物中心分笼饲养（5只/笼），饲养环境为SPF级别，提供充足水和饲料，饲养室提供节律光照和独立通风系统。ct26.wt细胞系和mc38细胞系购买自BOSTER生物工程有限公司（中国，武汉），细胞培养相关实验在无菌条件下操作，处理细胞前需将超净台，移液器，离心管及培养皿等所用试剂和器具用紫外灯照射30min。细胞复苏：从液氮或-80℃冰箱中取出冻存的细胞，迅速放入37℃水浴锅中，待细胞完全解冻后转移到15mL离心管中，1000rpm离心3min，弃上清后加入1ml新鲜培养基重悬细胞。将细胞悬液转移到细胞培养瓶中，再加入3-4mL培养基，混匀后放入37℃细胞培养箱中培养。RPMI-1640完全培养基含有10%胎牛血清和100UmL青霉素和100μg/mL链霉素的，细胞培养箱设为5%CO2 37℃恒温。实验伦理由南开大学动物福利伦理审查委员会通过，审批号2024-SYDWLL-000468。
生物信息学分析. 数据获取:从GEO数据库（Gene Expression Omnibus, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）下载CRC放疗联合免疫检查点抑制剂的数据集以及未经过治疗和药物处理的结直肠癌样本GSE179351。The study is a phase II trial evaluating nivolumab and ipilimumab in microsatellite stable, chemorefractory colon cancer and pancreatic cancer. 差异基因分析和功能富集分析:基于R语言的limma或Deseq2对两组样本进行差异表达分析，以|log2FC|>1和adjust.P value<0.05为标准筛选差异表达基因，观测治疗前后基因表达水平变化。对得到的差异基因进行GO terms（Gene ontology，包括Biological Process、Molecular Function和Cellular Compone）和KEGG pathways（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)）富集分析。用R语言包GSVA来计算每个样本内富集的KEGG通路得分，并且用Wilcoxon秩和检验来计算两组间KEGG通路得分的差异情况，P值<0.05被认为显著差异富集的通路。免疫浸润分析：使用软件CIBERSORT来计算样本中22种免疫细胞的相对比例。使用CIBERSORT软件，根据基因表达矩阵，利用反卷积算法使用预置的547个barcode基因来表征免疫浸润细胞的组成。每个样本中所有估计的免疫细胞类型比例之和等于1。使用“estimate”函数包（https://R-Forge.R-project.org/projects/estimate/ ,version 1.0.13）计算两组样本的基质和免疫细胞得分，分析IFN-γ基因和各免疫细胞的相关性。分析IFN-γ表达与JAK-STAT信号通路相关调控基因的相关性，分析JAK-STAT与细胞凋亡的相关性。采用Wilcoxon秩和检验比较不同组间的基因表达差异和免疫细胞的浸润差异。使用R语言“cor”函数进行Spearman相关性分析。
主要试剂. Anti-Mouse PD-L1/B7-H1 Antibody (10F.9G2)，#HY-P99145，MedChemExpress；IFN-gamma Protein, Mouse (HEK293)，#HY-P70667，MedChemExpress。
体内实验. 雄性6周龄Balb/c小鼠备皮后，于右侧背部皮下注射PBS稀释的细胞悬液100μl，约1.0×106个ct26.wt小鼠结肠腺癌细胞。待小鼠皮下形成直径约6mm的瘤块（约1周时间），将小鼠随机分成4组进行后续实验，荷瘤模型建立过程中全部小鼠成瘤率约90%。荷瘤小鼠随机分为4组：对照组：不给予抗肿瘤治疗；IR组（18Gy/3 f）：第1、3、5天分别给与6Gy局部6MV X线照射，剂量率2Gy/min，照射野为2cmx40cm。照射前腹腔注射2.5%三溴乙醇（0.2ml/10g）进行麻醉，麻醉后使小鼠左侧卧位并横向排列，使用胶带固定，固定小鼠后确认皮下肿瘤位于照射野中，给予1.5cm皮肤补偿。ICI组：第2、4、6天分别腹腔注射抗小鼠PD-L1抗体(10mg/kg)，注射点选为右下腹部。IR+ICI组：第1、3、5天进行照射，方法同前，第2、4、6天注射抗PD-L1抗体，方法同前，联合治疗方案的制订参考了研究内容相似的文献15,16。治疗开始后隔日测量皮下肿瘤长径及短径，计算肿瘤体积，使用公式volume = L × W2/2，隔日测量小鼠体重。治疗终点为初始治疗后第7天，小鼠体重下降20%，、肿瘤直径大于20mm或肿瘤严重影响小鼠行动能力时将终止实验。到达治疗终点时，吸入异氟烷麻醉后脱颈处死小鼠。
体外实验. ct26.wt和mc38细胞系生长至80%90%进行传代，按照不同干预措施进行分组、铺板，给予重组IFN-γ前进行CCK-8细胞毒性实验，检测药物对细胞存活率的影响。实验分组：对照组：不给予干预；IR组：6Gy高能X线照射1次，剂量率为3Gy/min，源皮距为1m，照射野为40cm×40cm，皮肤补偿为1.5cm。IFN-γ组：培养基中加入重组IFN-γ蛋白（1ng/ml）。IR+IFNγ组：照射前2小时在培养基中加入IFN-γ，照射及给药方式同前。干预6小时后收获所有细胞，使用预冷PBS清洗后进行后续实验。
免疫组织化学染色. 收获体内实验肿瘤组织，PBS清洗后泡入福尔马林固定，进行石蜡包埋，间隔4μm切片制成石蜡切片。切片置于恒温烤箱中65℃烘烤2小时，待组织中石蜡完全融化，取出切片脱蜡并水化：15分钟二甲苯脱蜡2次，梯度酒精水化：无水乙醇10分钟-无水乙醇10分钟-95%乙醇5分钟-90%乙醇5分钟-80%乙醇5分钟，水化后自来水漂洗，将切片浸泡于EDTA修复液（pH=8.0）中，使用高压法进行抗原修复，待切片冷却至室温，用PBS冲洗3次，每次5分钟。距离切片上组织约2 mm处，使用中性油笔在组织周围画疏水圈，在圈中滴加适量的内源性过氧化物酶阻断剂覆盖组织，避光孵育15分钟，防止内源性过氧化物酶影响染色结果。孵育结束后，用PBS轻轻冲洗3次，每次5分钟，在组织上滴加适量的封闭用山羊血清，覆盖组织，室温孵育20分钟，封闭非特异性背景。倾去封闭血清，滴加适量的一抗，PBS代替一抗设置阴性对照，将切片置于湿盒中，4℃孵育过夜（一抗：CD3，#S0B2132，STARTER；CD8，#S0B0034，STARTER；p-STAT1（Ser727），#AF3299，Affinity；STAT1，#AF6300，Affinity；p-JAK1（Tyr1022），#AF2012，Affinity；JAK1，#AF5012，Affinity，Cleaved Caspase-3 (Asp175)，#9661，Cell Signaling Technology）。次日取出湿盒，室温放置30分钟，使用PBS冲洗3次，每次5分钟，滴加适量的生物素标记的山羊抗小鼠/兔IgG聚合物（使用SABC法（Strept Avidin-Biotin Complex）），室温孵育30分钟，PBS冲洗3次，每次5分钟。在组织上滴加足够的辣根酶标记的链霉卵白素工作液，室温孵育15分钟，PBS冲洗3次，每次5分钟。配制DAB液体，（DAB浓缩液和DAB底物液的配制比例为1:20），充分混匀，缓慢的滴加适量到细胞上，避光孵育，显微镜下观察，当细胞胞浆或胞核出现棕色的颗粒状染色时终止显色反应，自来水冲洗多余的显色液。组织切片经苏木素复染约30-40秒，自来水冲洗干净，温水返蓝约5分钟，然后经梯度酒精脱水（75%乙醇5分钟、80%乙醇5分钟、95%乙醇5分钟、无水乙醇5分钟，2次），二甲苯透明（10分钟×2次），中性树胶封片，切片经过荧光显微镜（Olympus，Japan）阅片并采集图像，图像使用ImageJ 1.51软件（National Institutes of Health，USA）进行定量分析，以累积光密度值（Integratedoption density，IOD）表示目的蛋白总量。
蛋白提取和Western Blot. 收获的肿瘤组织和细胞中加入细胞裂解液RIPA（Radioimmunoprecipitation Assay）和蛋白酶抑制剂PMSF（Phenylmethylsulfonyl Fluorid），超声裂解后离心，制备蛋白匀浆。按BCA法（Bicinchoninic Acid）测定的蛋白浓度计算上样量，选定蛋白总量为30ug。将玻璃板蒸馏水洗干净，置于制胶器上。根据目的蛋白大小配制10%浓度的PAGE分离胶（上海雅酶生物医药科技有限公司）：沿着玻璃板一侧缓慢匀速的向玻璃板中灌胶（避免气泡产生），待胶面升至合适高度，加入1ml异丙醇液封，约30min在液封部位出现一条明显的分界线，弃去异丙醇。配好浓缩胶后，迅速加入到玻璃板中，水平均匀地插入梳子，室温静置30min。将两块胶置于电泳槽中固定后，分别加入内液和外液，拔出梳子。按计算上样量依次加入待测样品和5ul预染蛋白Marker，恒压80V电泳约30min，待Marker分开后调至120V，恒压电泳约60min。提前配制转膜缓冲液，冰箱中预冷。根据Marker条带判断目的蛋白大致所在位置，将多余的凝胶切除，根据所要转凝胶的大小裁剪PVDF膜，无水甲醇中浸泡使其正电基团被活化，活化5 min，活化结束放在转膜缓冲液中，按照三明治转膜法：白色夹子-海绵垫-滤纸- PVDF膜-凝胶-滤纸-海绵垫-黑色夹子的顺序夹好。在放凝胶和膜之前将海绵垫和滤纸中的气泡排除，以免影响转膜效果。将转膜夹放入转膜槽中加满电泳液，将转膜槽放入冰中。恒流200mA转膜,转膜时间根据目的蛋白分子量计算。室温下使用TBST洗膜3次，匀速摇床中洗膜，每次5分钟。转膜结束后，取出PVDF膜（剪膜的左上角作为方向标记），加入TBST，摇晃清洗3次，每次5分钟，然后将膜置于5%BSA封闭液（Bovine Serum Albumin, BSA)中，室温摇晃孵育1-2小时，封闭非特异性背景。封闭结束后，用TBST清洗3次，每次5分钟。一抗按1：1000WB一抗稀释液（上海碧云天生物技术有限公司）稀释，然后将膜置入相应的一抗中，4℃缓慢摇晃孵育过夜。孵育的一抗包括：p-STAT1（Ser727），#AF3299，Affinity； STAT1，#AF6300，Affinity；p-JAK1（Tyr1022），#AF2012，Affinity；JAK1，#AF5012， Affinity，Cleaved Caspase-3 (Asp175) ，#9661，Cell Signaling Technology，β-acin，#3700，Cell Signaling Technology。一抗孵育结束后，用TBST清洗3次，每次5分钟，置入相应的二抗中，室温缓慢摇晃孵育1-2小时。孵育的二抗包括：兔抗IgG(#14708, Cell Signaling Technology )、鼠抗IgG (#14709, Cell Signaling Technology)。二抗孵育结束后，TBST洗3次，每次10-15分钟，使用ECL发光试剂盒（南京诺唯赞生物科技股份有限公司）检测蛋白质表达情况，显色条带经Image-J软件测定灰度值，再与内参条带对比后，用于各组样品分析。
细胞因子检测（ELISA）. 收获的肿瘤和脾脏经由磁珠机械裂解后提取上清液，使用IFN-γ ELISA试剂盒进行细胞因子检测（# E-EL-M0048，Elabscience）。实验开始前，各试剂和样本均应平衡至室温，试剂或样本配制时，需充分混匀并尽量避免起泡，标曲和样本做复孔检测。将标准品工作液依次加入到前两列孔中，每个浓度的工作液并列加两孔，每孔100 μL。待测样品加入到其他孔，每孔100 μ。加样时将样品加于酶标板底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀，避免产生气泡。加样时间控制在10分钟内。给酶标板覆膜，37℃孵育90分钟。弃去液体，甩干，不洗涤。每个孔中立即加入生物素化抗体工作液100 μL，混匀，酶标板加上覆膜，37℃孵育1小时。甩尽孔内液体，每孔加洗涤液350 μL，浸泡1-2分钟，吸去或甩掉酶标板内的液体，在厚的吸水纸上拍干。重复此洗板步骤3次。每孔加HRP酶结合物工作液100 μL，混匀，加上覆膜，37℃孵育30分钟。弃去孔内液体，洗板5次，方法同前。每孔加底物溶液(TMB) 90 μL，混匀，加上覆膜，37℃避光孵育约15分钟。根据实际显色情况酌情缩短或延长孵育时间，当标准孔出现明显梯度时，即可终止反应。每孔加终止液50 μL，终止反应，终止液的加入顺序应尽量与底物溶液的加入顺序相同。立即用酶标仪在450 nm波长测量各孔的光密度(OD值)。IFN-γ浓度与OD450值之间呈正比，通过绘制标准曲线计算出样品中IFN-γ的浓度。
流式细胞技术. 取出小鼠脾脏，并浸泡于干净的PBS溶液中。将脾脏置于200目筛网中，用组织研磨棒轻轻研磨至没有明显红色块状物。用15 mL PBS冲洗筛网，并将冲洗液收集于15 mL离心管中，300 g离心5 min，弃上清。 加入2 mL 1×红细胞裂解液（Elabscience Biotechnology Co.,Ltd.）重悬细胞，室温裂解23 min后，立刻加入10 mL PBS，300 g离心5 min，弃上清。用细胞染色缓冲液重悬脾脏细胞，将细胞悬液用200目筛网再次过滤后计数, 并调整细胞浓度至1×107个/mL。按照说明书的推荐用量加入荧光标记的抗体，混匀后置于4℃，避光孵育30分钟。加入适量细胞染色buffer （Elabscience Biotechnology Co.,Ltd.）重悬细胞，300g离心细胞悬液5分钟，弃掉上清。加入0.2 mL细胞染色buffer重悬细胞，用流式细胞仪进行检测和分析（四激光16色，BD FACSymphony A1流式细胞仪，上海碧迪医疗器械有限公司）。抗体及配色方案：CD45-ER780，#E-AB-F1136S，Elabscience；CD3-EV450，#E-AB-F1013Q，Elabscience；CD4-FITC，#E-AB-F1353C，Elabscience；CD49b-APC，#E-AB-F1116E，Elabscience；CD3-PE，#E-AB-F1013D，Elabscience；CD8-APC，#E-AB-F1104E，Elabscience。上机后进行电压调节、补偿调节，制定圈门策略，实验数据使用FlowJo v10.8.1软件（Becton, Dickinson and Company，State of New Jersey， USA）进行分析和绘图。
统计分析. 数据以平均值表示，组间差异分析使用单因素方差分析。∗, ∗∗, ∗∗∗, or ∗∗∗∗ 分别代表P值 <0.05,<0.01, <0.001 or <0.0001。统计分析和绘图使用SPSS 28.0.1.1 （IBM，New York，Armonk ，USA）和GraphPad Prism software 7.0 (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA)。
结果
放疗联合免疫检查点抑制剂治疗前后差异基因分析. 为探究放疗联合免疫检查点抑制剂治疗后的差异情况，对治疗前后患者进行组间差异分析，认为|log2FC|>1且p-value<0.05的基因为具有显著差异的基因，一共得到701个差异基因，其中568个上调基因（治疗后高表达），133个下调基因（Figure1A）。下调基因主要在GO通路细胞增殖与分化、代谢等过程发挥作用（Figure1B），上调基因的GO富集分析显示其在细胞凋亡过程发挥作用（Figure1C），KEGG富集分析显示其在细胞凋亡以及JAK-STAT信号通路中发挥作用（Figure1D）。这一结果说明放疗联合免疫检查点抑制剂治疗可能导致JAK-STAT信号通路激活并促进肿瘤细胞的凋亡。为了进一步探究放疗联合免疫检查点抑制剂治疗在结直肠癌中的作用机制，使用CIBERSORT对治疗前后患者进行免疫浸润分析，各样本中22种免疫细胞的比例如Figure2A所示，结果显示CD8+T细胞和Dendritic cells resting在治疗后显著上调，而T cells follicular helper和Macrophages M1在治疗后显著下调（Figure2B）。KEGG通路在样本中的评分结果表明放疗联合免疫检查点抑制剂治疗可能导致JAK-STAT信号通路激活并促进肿瘤细胞的凋亡。为了进一步验证此结果，使用GSVA来计算每个样本中KEGG通路得分（Figure3A-B）。细胞凋亡通路以及JAK-STAT信号通路得分箱线图（Figure3C）显示，虽然没有统计学差异，但从图中可以看出，两种通路评分在治疗后呈明显上升趋势，这进一步说明了放疗联合免疫检查点抑制剂治疗导致JAK-STAT信号通路的激活及肿瘤细胞的凋亡。
放射联合免疫治疗获得了更好的抗肿瘤效果. 免疫检查点抑制剂已经在结直肠癌的治疗中显示出显著疗效，但通常只有MMR缺陷或高度MSI（dMMR/MSI-H）者才能获益，而临床上大部分病人是MMR完整或微卫星稳定型（pMMR/MSS）。为了验证放疗联合免疫检查点抑制剂对pMMR/MSS型结直肠癌的治疗效果，我们设计体内实验，使用可以代表pMMR/MSS的小鼠ct26.wt结肠癌细胞系建立荷瘤动物模型，给予单独治疗或放射联合免疫检查点抑制剂治疗，探究不同的治疗方案对结直肠癌的抑制作用，同时验证上述生信分析的实验结果。为了探究放射和免疫治疗对肿瘤微环境的影响，我们选择免疫功能健全、与ct26同源的Balb/c小鼠建立动物模型。既往文献证明，低剂量分割放疗联合免疫治疗有着更好的协同作用17，结合预实验结果，本研究使用18Gy/3 f的放疗方案，抗PD-L1被设计在放疗的次日注射以起到更好的协同作用（Figure4A）。为了尽可能减少放射性肠炎的发生，肿瘤接种部位选择在右侧背部，照射时将小鼠左侧卧位并横向排列，将肿瘤置于照射野中（Figure4B）。由于放疗导致小鼠体重明显下降，出于伦理考虑，在开始治疗的第7天牺牲小鼠并收获肿瘤、脾脏、肺、肝脏、小肠等组织（Figure4C）。为消除干预前肿瘤原始大小的误差，采用肿瘤体积变化来反映肿瘤的生长（肿瘤体积生长=测量当日肿瘤体积-肿瘤原始体积），4个组（每组4只）肿瘤的生长情况如图（Figure4D）。如图所示，单独抗PD-L1治疗对ct26.wt（pMMR/MSS）构建的肿瘤几乎没有抑制作用，而放射治疗对肿瘤生长有着明显的抑制作用（平均肿瘤生长体积：IR 486mm3 vs对照1195mm3，P＜0.005）。同单独放射治疗相比，联合治疗更有效地抑制了肿瘤生长，虽然统计分析显示联合治疗同单独放疗相比没有明显的统计学差异（平均肿瘤生长体积：联合174mm3 vs IR 486mm3,P＞0.05），我们认为该结果可能源于较大的组间差异。我们使用小鼠的体重变化来表示治疗的耐受情况，4个组的小鼠体重变化曲线如图所示（Figure4E），给予放疗后小鼠体重出现明显下降，但联合免疫治疗并未加剧小鼠体重的下降(average body weight: combination 20.28 g vs. IR 18.95 g, P＞0.05)，上述结果说明放疗联合免疫检查点抑制剂对pMMR/MSS型结直肠癌有着令人满意的治疗效果和安全性。
联合治疗诱导了免疫激活状态的肿瘤微环境.放疗诱导免疫原性细胞凋亡从而促进T淋巴细胞的增殖与活化，改变肿瘤细胞表型，加强其免疫原性，促进免疫识别与抗肿瘤免疫应答，而免疫检查点抑制剂可以解除免疫细胞的抑制状态，增强免疫细胞对肿瘤的攻击能力，因此，我们认为联合治疗诱导了肿瘤微环境中的免疫激活状态，因而实现抗肿瘤作用。CD8+ T细胞在肿瘤免疫监视中发挥重要作用，它们通过识别肿瘤细胞表面呈递的异常抗原（如肿瘤抗原、变异蛋白等）来介导细胞毒性反应，进而抑制肿瘤的生长，肿瘤微环境中的炎症反应往往伴随着CD8+ T细胞的聚集和激活。前期生物信息分析显示联合治疗后微环境中CD8+T细胞显著上调，因此，我们在体内实验中使用免疫组化的方法分析治疗前后，肿瘤微环境中CD8阳性T细胞的浸润情况，用以表示微环境的“促炎”倾向，结果以CD3和CD8的IOD值之和表示。同时利用流式细胞仪分析小鼠脾脏的CD4阳性T细胞（CD45+、CD3+、CD4+）、CD8阳性T细胞（CD45+、CD3+、CD4-）的数量，用以表示外周免疫环境的免疫应答，结果以百分比表示。结果显示，在肿瘤微环境中，免疫检查点抑制剂、放疗均可诱导CD8阳性T细胞浸润，而相较单独治疗，联合治疗明显诱导了更多的CD8阳性T细胞浸润，免疫组化定量结果：CD3+CD8 IOD值：对照6,424,659 vs放射10,175,683 VS联合13,197,461，P＜0.05（Figure5A）。在外周免疫的细胞亚群中，联合治疗和单独放疗均可诱导产生更多T细胞，而相比单独治疗，联合治疗可诱导产生更多CD4阳性T细胞（流式细胞仪CD45+CD3+CD4+：对照13.6% vs放射19.9% vs联合25.5%）（Figure5B）。上述结果说明，联合治疗介导了“促炎性”的肿瘤微环境，我们进一步检测肿瘤微环境和外周免疫中的炎性因子水平，以探究肿瘤免疫微环境改变后，免疫细胞活性的变化。上述实验观察到免疫环境中CD8+T细胞和CD4+T细胞浸润增加，而这两种免疫细胞都是免疫反应中IFN-γ的主要来源14，因此后续研究我们以IFN-γ为核心探讨放射联合免疫治疗的抗肿瘤机制。IFN-γ是一类关键的免疫因子，在肿瘤清除、免疫逃逸、肿瘤微环境的建立与破坏等进程中起到关键作用。我们使用ELISA试剂盒测量肿瘤组织和脾脏组织中的IFN-γ水平，分别代表肿瘤微环境和外周免疫。结果显示，同免疫细胞亚群检测结果相符，无论是免疫微环境或外周免疫，联合治疗诱导产生了更多的IFN-γ（P＜0.05）（Figure5C）。
联合治疗通过IFN-JAK-Stat信号通路发挥抗肿瘤作用. 作为IFN-γ发挥效用的经典信号通路，JAK-STAT信号通路是细胞内重要的信号传导通路之一，广泛参与免疫反应、细胞增殖、分化以及生长等生物学过程18。生信分析中KEGG评分结果表明放疗联合免疫检查点抑制剂治疗可能导致JAK-STAT信号通路激活并促进肿瘤细胞的凋亡。因此，我们应用免疫组化检测肿瘤组织中JAK1-STAT1通路蛋白的表达情况以验证生信分析的实验结果。结果显示，联合治疗促进肿瘤细胞P-STAT1蛋白的表达，表示联合治疗可能导致肿瘤细胞内JAK1-STAT1通路的活化。考虑到肿瘤微环境中许多免疫因子具有交叉功能，为了验证IFNγ-JAK-Stat信号通路在抗肿瘤治疗过程中的作用，我们设计体外实验，构建了ct26和mc38鼠源结肠癌细胞模型，根据不同干预进行实验分组：对照组、IFN-γ组、照射组、联合组，干预措施如方法部分所述，收获细胞后使用WB检测信号通路相关蛋白表达水平。结果显示，IFN-γ明显激活ct26和mc38细胞的JAK1-STAT1通路，增加凋亡相关蛋白cleaved-caspase-3的表达，实验结果同体内实验的免疫组化结果一致（Figure6A-B）。该实验结果说明联合治疗通过诱导更高水平的IFN-γ，激活IFNγ-JAK-STAT信号通路，介导肿瘤细胞凋亡，实现抗肿瘤作用。
讨论
在这项研究中，我们从GEO数据库下载CRC放疗联合免疫检查点抑制剂的数据集进行差异基因分析和功能富集分析，发现肿瘤微环境的变化和目标信号通路，然后通过体内和体外实验进行验证。我们使用小鼠结肠癌细胞建立皮下荷瘤动物模型，随机分为对照、单独干预、或放疗联合抗PD-L1治疗组，肿瘤生长曲线反映出联合治疗对肿瘤生长的抑制作用最为明显，此外，小鼠体重变化曲线表示受到照射后小鼠体重出现下降，联合治疗组小鼠体重水平同单独治疗组相近。随后我们利用免疫组化检测了肿瘤组织微环境中CD8+T细胞的浸润情况，实验结果显示联合治疗在肿瘤微环境中诱导了更多的CD8+T细胞浸润。ELISA实验进一步显示，联合治疗使微环境中IFN-γ水平升高。至此，我们使用两种鼠源结肠癌细胞系进行体外实验，验证IFN-γ升高对肿瘤细胞内部信号通路的影响，并使用动物实验的肿瘤组织切片验证这一结论。结果显示，IFN-γ明显激活肿瘤细胞JAK/STAT信号通路，促进肿瘤细胞凋亡。同领域内其他研究相比，本实验并没有对肿瘤微环境中的多种免疫细胞、免疫因子进行广泛检测，而是结合生物信息分析结果，探究放射免疫联合治疗至肿瘤微环境变化，再到对肿瘤细胞的影响，阐述了从微环境免疫细胞、炎性因子到肿瘤细胞信号通路这条科学路线。
我们的前期研究发现，直肠腺癌患者行新辅助放疗后只有9%的患者达到病理完全缓解，为了使更多患者获益，从肿瘤微环境水平研究肿瘤辐射增敏机制具有重要意义。免疫检查点抑制剂虽然已经应用于临床并取得了良好的治疗效果，但是该类药物主要用于dMMR/MSI-H型结直肠癌，据统计，该类型患者占比仅5%，因此限制了该类药物的应用19。因此，在结直肠癌放射免疫联合治疗的领域，着眼于肿瘤微环境的机制研究十分重要。错配修复（Mismatched Repair, MMR）是细胞内的一种重要 DNA 修复机制，能够修复 DNA 复制过程中因碱基配对错误而产生的突变。该过程是通过一系列专门的基因和蛋白质来完成的，对于维持基因组的稳定性和防止癌症的发展至关重要20。本研究使用小鼠ct26结直肠癌细胞建立荷瘤模型，通常ct26细胞系被认为是微卫星稳定及错配修复基因完整型，代表了临床上大多数的结直肠癌患者。我们提出假设：对于临床上占比更多的微卫星稳定及错配修复基因完整型（pMMR/MSS）结直肠癌患者，放射联合PD-L1治疗可能有着很好的抗肿瘤效果，而本研究将为这一临床问题搭建理论基础，作为后续临床实验的前期研究。
放疗联合免疫检查点抑制剂是一种日益受到关注的癌症治疗策略。这种治疗方案结合了传统的放射治疗与新兴的免疫治疗，旨在通过协同作用增强抗癌效果，在放射免疫治疗的基础上再联用佐剂也是近些年的研究热点之一15,16。将放疗与免疫检查点抑制剂结合使用，能够产生协同效应，增强抗肿瘤免疫反应。放疗能够引发肿瘤细胞的死亡，并释放肿瘤抗原。这些抗原可以被树突状细胞摄取并呈递给T细胞，从而激活特异性免疫反应21。另外，放疗通过改变肿瘤微环境（如增加免疫细胞的浸润）来增强免疫检查点抑制剂的效果22。对于不可切除的肿瘤，目前已经有临床实验使用放疗联合免疫检查点抑制剂的治疗策略取得了满意的效果8,23-26。然而，鉴于肿瘤微环境的复杂性，还需要更多的研究去探讨放射免疫联合治疗的抗肿瘤治疗机制。在我们的研究中，联合治疗显示出最明显的肿瘤抑制效果，尽管同放射组相比未显示出统计学差异，但这可能同较大的组内数据差异相关。同预期相符的是，单用抗PD-L1药物几乎不能抑制ct26.wt细胞系生成的皮下肿瘤的生长。当我们观察到小鼠体重出现大幅下降，出于伦理我们牺牲了小鼠并收集肿瘤，肿瘤生长的趋势说明，如果能延长小鼠的带瘤生存时间，联合治疗将显示出更为明显的肿瘤抑制作用。尽管加强了营养供应，照射后小鼠的体重仍出现大幅度下降，这可能源于不够精确的照射窗口，后续研究中我们将尝试使用“照射光栅”来保护肿瘤照射野之外的脏器。我们观察到加用抗PD-L1后并未加重小鼠体重下降，联合组和照射组小鼠的体重也没有统计学差异，说明联合治疗的安全性是足够的，尽管近些年有文章报道了ICI潜在危及生命的炎症毒性，涉及胃肠道和肝脏27。
肿瘤微环境的改变对抗肿瘤治疗的效果有着直接的影响，但是实际上实体肿瘤当中免疫细胞的数目非常少，因此选择恰当的检测方法十分重要。目前肿瘤微环境的检测方式主要有流式细胞仪、多重免疫组化等。在预实验中，我们发现以肿瘤组织为样本的流式检测结果中，目的免疫细胞的分群情况并不理想，为了得出准确的实验结论，我们选择用流式细胞仪检测脾脏中的免疫细胞，用以表示外周免疫反应，脾脏作为动物体内的主要免疫器官，当中包含大量的免疫细胞，因此在流式细胞仪中可以得到偏倚更少、更具统计学差异的实验结果。另一种检测方法是多重免疫组化，在预实验送检的切片中，我们发现肿瘤组织中只有T淋巴细胞是易于观察的，而其他免疫细胞由于含量过少，无法得出有效结论。于是我们选择普通的免疫组化染色来表示肿瘤当中T淋巴细胞的分布，使用多张肿瘤组织连续切片孵育不同的抗体，以确定染色阳性的细胞是目的免疫细胞。白光扫描的图片使用ImageJ定量，为避免选择偏倚，定量过程由其他不知晓实验分组情况的实验人员完成。肿瘤细胞的信号通路表达情况也由免疫组化检测，实际上我们对待测通路的多个蛋白均做了染色，尽管调整了抗体浓度，仍存在过表达的情况，为了科学、合理地定量，我们选择P-STAT1表示肿瘤细胞中该通路的活化情况。WB经常被用于检测通路激活情况，但肿瘤组织的WB实验结果无法令人满意，我们认为实验结果无法真实地反应通路蛋白的表达，因此我们只在体外实验中使用WB检测待测的信号通路。实验结果证实，放疗联合免疫检查点抑制剂能够更为明显地诱导肿瘤微环境中CD8阳性T细胞的浸润，导致肿瘤微环境的“促炎性”改变，同时JAK/STAT通路被激活，诱导肿瘤细胞凋亡，实现肿瘤生长抑制作用。
生物信息实验和体内实验结果显示免疫环境中CD8+T细胞和CD4+T细胞浸润增加，肿瘤细胞JAK/STAT通路被激活，根据已知信息这两种免疫细胞都是免疫反应中IFN-γ的主要来源28，而JAK/STAT通路是IFN-γ发挥生物学作用的经典通路。我们认为IFN-γ是连接免疫微环境和抗肿瘤机制的“桥梁”，于是我们将IFN-γ作为后续研究抗肿瘤机制的核心。IFN蛋白家族分为3大类：Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型。干扰素-γ是Ⅱ型干扰素家族中的唯一成员， 它是一类促炎性细胞因子，主要由T淋巴细胞、自然杀伤细胞（NK）和自然杀伤T细胞（NKT）细胞分泌，能够参与体内获得性免疫和固有免疫应答，具有调节机体的免疫状态、抗病毒感染及抗肿瘤等生物学活性，在免疫防御体系中发挥关键作用29。IFN-γ在肿瘤微环境中的作用十分复杂，它既发挥抗肿瘤作用，在某些条件下也有促进肿瘤发生的作用。IFN-γ明显增加肿瘤细胞表面PD-L1的表达，通过与免疫细胞表面的PD-1受体结合，抑制免疫反应，从而帮助肿瘤逃逸宿主的免疫监视30。在放射免疫联合治疗模型中，有可能正是免疫检查点抑制剂的加入，抵消了IFN-γ的免疫抑制作用，增强抗肿瘤免疫反应18。IFN-γ的生物学效应是通过激活细胞内分子信号网络引起的，IFN-γ与其受体（由IFNGR1和IFNGR2亚单位组成）结合后，受体的胞内部分暴露出来，与JAK1和JAK2（Janus激酶）结合，JAK1通常与IFNGR1亚单位结合，JAK2则与IFNGR2亚单位结合。同时受体发生二聚化，在其刺激下，JAK激酶通过磷酸化受体上的酪氨酸残基（ITAM区），提供STAT蛋白结合位点。STAT1蛋白被招募到受体复合物上并被JAK激酶磷酸化，磷酸化后的STAT1发生构象变化，形成二聚体，并从受体复合物中解离。二聚化后的STAT1进入细胞核，结合到DNA中的特定序列（如γ-激活序列（GAS）），启动一系列基因的转录31。STAT1通常与促凋亡信号相关，激活STAT1后，它可以上调促凋亡基因，从而诱导细胞凋亡。为了验证上述假设，我们构建了ct26.wt和mc38两种体外实验模型，实验结果表明而单独放疗并不能激活JAK/STAT通路，而IFN-γ可以明显激活肿瘤细胞JAK/STAT通路，并上调凋亡基因表达。因此我们认为联合肿瘤诱导肿瘤微环境改变，上调IFN-γ水平，导致肿瘤细胞JAK/STAT通路激活，诱导肿瘤细胞凋亡，最终实现抗肿瘤作用。
本实验的不足之处之一是肿瘤微环境的检测方法选择了连续切片的普通免疫组化。作为主流的检测方法，流式细胞仪可以清晰地区分不同的免疫细胞亚群，进而探讨目的免疫细胞的功能。我们的团队希望在后续的实验中克服技术限制，使用流式细胞仪更全面地探讨干预前后肿瘤微环境的变化。多重免疫荧光是一种全面、直观的检测方法，而且可以展示肿瘤边缘或中心区域免疫细胞的浸润情况。多重免疫组化同时检测多个指标的意义在于，肿瘤微环境的“促炎性”或“抑炎性”不是某一种免疫细胞就可以决定的，而且微环境中存在大量的抑制炎症反应细胞，检测不同亚群的免疫细胞有助于全面理解微环境的变化。在体外实验中，我们选择直接在肿瘤细胞的培养基中加入干扰素-γ作为药物干预，实际上我们的给药浓度未必同真实的微环境保持一致，因此T细胞和肿瘤细胞联合培养的实验模型可能是更好的选择。我们希望在后续实验中使用联合培养模型，这样可以更好地探讨不同干预下免疫细胞和肿瘤细胞的形态和功能变化。
5.结论
总结，放疗联合免疫检查点抑制剂在结直肠癌肿瘤微环境中诱导了更多的CD8阳性T细胞浸润，继而增加了微环境中的IFN-γ水平，高水平的IFN-γ激活了肿瘤细胞的JAK-STAT信号通路，促进肿瘤细胞凋亡。作为结果，放射免疫联合治疗相比单独放疗更有效地抑制了小鼠模型皮下肿瘤的生长。我们的研究证实放疗联合免疫检查点抑制剂对pMMR/MSS型结直肠癌患者具有良好的治疗前景，这项研究为结直肠癌的放射免疫联合治疗提供理论依据和实验基础，在免疫治疗突飞猛进的时代，我们希望使更多病人从中获益。

参考文献

1. Sung H, Ferlay J, Siegel RL, et al. Global Cancer Statistics 2020: GLOBOCAN Estimates of Incidence and Mortality Worldwide for 36 Cancers in 185 Countries. CA: a cancer journal for clinicians 2021; 71(3): 209-49.
2. Cao W, Chen HD, Yu YW, Li N, Chen WQ. Changing profiles of cancer burden worldwide and in China: a secondary analysis of the global cancer statistics 2020. Chinese medical journal 2021; 134(7): 783-91.
3. Biller LH, Schrag D. Diagnosis and Treatment of Metastatic Colorectal Cancer: A Review. Jama 2021; 325(7): 669-85.
4. Schrag D, Shi Q, Weiser MR, et al. Preoperative Treatment of Locally Advanced Rectal Cancer. N Engl J Med 2023; 389(4): 322-34.
5. Wu C, Shao Y, Gu W. Immunotherapy combined with radiotherapy to reverse immunosuppression in microsatellite stable colorectal cancer. Clinical & translational oncology : official publication of the Federation of Spanish Oncology Societies and of the National Cancer Institute of Mexico 2023; 25(7): 1916-28.
6. Ji K, Jia H, Liu Z, et al. New insight in immunotherapy and combine therapy in colorectal cancer. Front Cell Dev Biol 2024; 12: 1453630.
7. Le DT, Uram JN, Wang H, et al. PD-1 Blockade in Tumors with Mismatch-Repair Deficiency. N Engl J Med 2015; 372(26): 2509-20.
8. Le DT, Diaz LA, Jr., Kim TW, et al. Pembrolizumab for previously treated, microsatellite instability-high/mismatch repair-deficient advanced colorectal cancer: final analysis of KEYNOTE-164. European journal of cancer (Oxford, England : 1990) 2023; 186: 185-95.
9. Sharma P, Goswami S, Raychaudhuri D, et al. Immune checkpoint therapy-current perspectives and future directions. Cell 2023; 186(8): 1652-69.
10. André T, Shiu KK, Kim TW, et al. Pembrolizumab in Microsatellite-Instability-High Advanced Colorectal Cancer. N Engl J Med 2020; 383(23): 2207-18.
11. Xia F, Wang Y, Wang H, et al. Randomized Phase II Trial of Immunotherapy-Based Total Neoadjuvant Therapy for Proficient Mismatch Repair or Microsatellite Stable Locally Advanced Rectal Cancer (TORCH). J Clin Oncol 2024; (0): JCO2302261.
12. Shi J, Sun Z, Gao Z, Huang D, Hong H, Gu J. Radioimmunotherapy in colorectal cancer treatment: present and future. Frontiers in immunology 2023; 14: 1105180.
13. Alimohammadi M, Ghaffari-Nazari H, Alimohammadi R, Bakhshandeh M, Jalali SA, Rezaei N. Radiotherapy Combination: Insight from Tumor Immune Microenvironment (TIME). Avicenna journal of medical biotechnology 2023; 15(4): 209-15.
14. Ding H, Wang G, Yu Z, Sun H, Wang L. Role of interferon-gamma (IFN-γ) and IFN-γ receptor 1/2 (IFNγR1/2) in regulation of immunity, infection, and cancer development: IFN-γ-dependent or independent pathway. Biomedicine & pharmacotherapy = Biomedecine & pharmacotherapie 2022; 155: 113683.
15. Yuan M, Zhai Y, Men Y, et al. Anlotinib Enhances the Antitumor Activity of High-Dose Irradiation Combined with Anti-PD-L1 by Potentiating the Tumor Immune Microenvironment in Murine Lung Cancer. Oxidative medicine and cellular longevity 2022; 2022: 5479491.
16. Sheng H, Huang Y, Xiao Y, et al. ATR inhibitor AZD6738 enhances the antitumor activity of radiotherapy and immune checkpoint inhibitors by potentiating the tumor immune microenvironment in hepatocellular carcinoma. Journal for immunotherapy of cancer 2020; 8(1).
17. Patel RB, Hernandez R, Carlson P, et al. Low-dose targeted radionuclide therapy renders immunologically cold tumors responsive to immune checkpoint blockade. Science translational medicine 2021; 13(602).
18. Shi LZ, Bonner JA. Bridging Radiotherapy to Immunotherapy: The IFN-JAK-STAT Axis. International journal of molecular sciences 2021; 22(22).
19. Zhu J, Lian J, Xu B, et al. Neoadjuvant immunotherapy for colorectal cancer: Right regimens, right patients, right directions? Frontiers in immunology 2023; 14: 1120684.
20. Ijsselsteijn R, Jansen JG, de Wind N. DNA mismatch repair-dependent DNA damage responses and cancer. DNA Repair (Amst) 2020; 93: 102923.
21. Liu T, Pei P, Shen W, Hu L, Yang K. Radiation-Induced Immunogenic Cell Death for Cancer Radioimmunotherapy. Small methods 2023; 7(5): e2201401.
22. Colciago RR, Fischetti I, Giandini C, et al. Overview of the synergistic use of radiotherapy and immunotherapy in cancer treatment: current challenges and scopes of improvement. Expert review of anticancer therapy 2023; 23(2): 135-45.
23. Zhang H, Li Y, Xia F, et al. Study protocol of short-course radiotherapy combined with CAPOX and PD-1 inhibitor for locally advanced colon cancer: a randomised, prospective, multicentre, phase II trial (TORCH-C). BMJ open 2024; 14(2): e079442.
24. Zhao ZR, Liu SL, Zhou T, et al. Stereotactic body radiotherapy with sequential tislelizumab and chemotherapy as neoadjuvant therapy in patients with resectable non-small-cell lung cancer in China (SACTION01): a single-arm, single-centre, phase 2 trial. Lancet Respir Med 2024; 12(12): 988-96.
25. Zhai M, Zhang Z, Wang H, et al. Efficacy and safety of radiotherapy combined with anti-angiogenic therapy and immune checkpoint inhibitors in MSS/pMMR metastatic colorectal cancer. Cancer medicine 2024; 13(1): e6820.
26. Xiao WW, Chen G, Gao YH, et al. Effect of neoadjuvant chemoradiotherapy with or without PD-1 antibody sintilimab in pMMR locally advanced rectal cancer: A randomized clinical trial. Cancer cell 2024; 42(9): 1570-81.e4.
27. Dougan M, Wang Y, Rubio-Tapia A, Lim JK. AGA Clinical Practice Update on Diagnosis and Management of Immune Checkpoint Inhibitor Colitis and Hepatitis: Expert Review. Gastroenterology 2021; 160(4): 1384-93.
28. Han J, Wu M, Liu Z. Dysregulation in IFN-γ signaling and response: the barricade to tumor immunotherapy. Frontiers in immunology 2023; 14: 1190333.
29. Jorgovanovic D, Song M, Wang L, Zhang Y. Roles of IFN-gamma in tumor progression and regression: a review. Biomark Res 2020; 8: 49.
30. Song M, Ping Y, Zhang K, et al. Low-Dose IFNgamma Induces Tumor Cell Stemness in Tumor Microenvironment of Non-Small Cell Lung Cancer. Cancer Res 2019; 79(14): 3737-48.
31. Ivashkiv LB. IFNgamma: signalling, epigenetics and roles in immunity, metabolism, disease and cancer immunotherapy. Nat Rev Immunol 2018; 18(9): 545-58.

图例
Figure1:差异分析(A)差异基因火山图.(B)下调组GO富集通路图.(C)上调组GO富集通路图.(D)上调组KEGG富集通路图.
Figure2:CIBERSORT免疫浸润分析(A)免疫细胞比例图.(B)箱线图显示两组免疫细胞表达情况.
Figure3:GSVA分析热图(A)-(B)显示各KEGG通路在不同样本中的评分. (C)箱线图显示JAK-STAT信号通路以及凋亡相关通路在两组中的表达情况.
Figure4: (A)体内实验治疗策略.(B)荷瘤小鼠麻醉后进行照射. (C)收获皮下肿瘤组织进行测量. （D）肿瘤组织生长曲线. （E）小鼠体重变化曲线.
Figure5: (A)免疫组化检测肿瘤组织CD3、CD8表达. (B)流式细胞技术检测脾脏组织T淋巴细胞分群.（C）ELISA检测肿瘤和脾脏中IFN-γ水平.
Figure6: (A)免疫组化检测肿瘤组织P-STAT1表达. (B)体外实验中WB检测不同干预下肿瘤细胞JAK/STAT通路激活情况.

我对关键问题1有异议，这是数据集相关SCI文章原文的方法部分，明确说明了治疗方案是放疗结合免疫检查点抑制剂。
Study Design and Treatment
This was an open-label, single-arm, Phase 2 clinical trial conducted at the Massachusetts General Hospital (MGH) Cancer Center in Boston, MA. Patients enrolled between 07/2017 to 12/2018. On cycle 1, day 1, patients received one dose of nivolumab 240 mg and ipilimumab 1 mg/kg. Nivolumab was administered first as a 30-minute IV infusion followed by ipilimumab, as a 30-min IV infusion, 30 minutes after completion of the nivolumab infusion. Patients went on to receive nivolumab 240 mg once every two weeks, on days 15, 29 of a 42-day cycle. On cycle 2, day 1, patients again received nivolumab 240 mg and ipilimumab 1 mg/kg but also started radiation. Patients received 24 Gy total given as 3 fractions of 8 Gy administered every other day or 2 days as needed. All treatments were administered at either the Clark Center for Radiation Oncology or the Francis H. Burr Proton Center at MGH. After radiation, treatment continued with receive nivolumab 240 mg days every two weeks, on days 15, 29 of a 42-day cycle. For cycle 3 and beyond, patients continued treatment with ipilimumab 1 mg/kg on day 1 with nivolumab 240 mg and then nivolumab every two weeks for a 42 day cycle until disease progression defined according to Response Evaluation Criteria in Solid Tumors version 1.147, unacceptable toxicity, or withdrawal. Dose interruptions and management of immunologic toxicities were in accordance with the protocol.

关于统计方法与呈现： ① 文中多处使用单因素方差分析，但 Figure 4 为 2 × 4 重复测量曲线，更合适的是混合线性模型或两因素 RM‑ANOVA。<br>② 多重检验校正仅在转录组部分提及，后续免疫组化/流式/ELISA 未说明。<br>▪ 建议：补充方法细节，或者在讨论中说明局限。
我的统计学基础很弱，可以展开说明一下吗

误差条含义（SEM/SD），我也搞不清楚，我是用graphpad prism软件完成的单因素方差分析，展示结果中有Mean Diff. SE of diff，帮我看一下误差条到底是哪一种

可在 Discussion 加入与现有临床试验 (如 TORCH, TORCH‑C) 的对比，强调“增敏 pMMR/MSS”这一未满足需求。
我们医院本身就是TORCH的中心之一，请为我简要写两句本篇文章与该临床试验的对比吧，强调一下
“增敏 pMMR/MSS”这一未满足需求。