一、研究总体设计与技术路线 1. 研究假设 JAK2V617F突变通过激活中性粒细胞内的mTOR信号...

研究方法（整理与修订稿）

动物与饲养条件
实验动物包括野生型 C57BL/6J 小鼠与动脉粥样硬化易感 Ldlr^-/- 小鼠（B6.129S7-Ldlr^tm1Her/J 背景），并使用 Mx1-Cre;Jak2^V617F 小鼠作为供体来源。全程选用 6–8 周龄雌性小鼠以降低性别相关偏倚。动物饲养于 SPF 条件下，12 h 光/暗循环，自由摄食饮水，温度维持 22±2°C、湿度 50±10%。所有动物实验均经机构动物护理与使用委员会审批；分组、取材、图像采集与定量分析实施随机化与盲法编码，确保结果的客观性与可重复性。

基因分型与实验前质量控制
断奶后 2–3 周采集尾尖组织提取基因组 DNA，采用商业化 DNA 提取试剂盒（如 Tiangen/天根或 Qiagen）完成样本制备；使用 Taq DNA Polymerase PCR 体系扩增 Mx1-Cre 与 Jak2^V617F 等位基因片段，PCR 产物经琼脂糖凝胶电泳判读完成基因分型。实验开始前对所有小鼠进行体重、一般状况与感染筛查，剔除存在严重感染、体重显著异常或其他不适合实验的个体；在骨髓移植后持续记录体重变化与生存状态，并将伦理终止标准（体重下降超过 20% 或出现明显衰竭）纳入脱落判定与记录。

Jak2^V617F 造血嵌合模型的构建（骨髓移植）
供体 Mx1-Cre;Jak2^V617F 小鼠通过 poly(I:C)（pI:pC）诱导启动 Cre 重组，采用腹腔注射 10 mg/kg、每 48 h 1 次、共 3 次的方案诱导；诱导后等待 4 周以使造血系统稳定表达 Jak2^V617F。受体选择 WT 或 Ldlr^-/- 小鼠，实施致死照射总剂量 10.5 Gy，并采用分次照射（两次完成、间隔 3–4 h）以降低胃肠毒性；同步记录照射来源（X 射线或 γ 射线）、剂量率与照射参数。照射后给予支持治疗，移植后 2 周饮水中加入恩诺沙星（enrofloxacin）进行抗感染管理，并连续监测体重与体温。

骨髓细胞制备时取供体股骨与胫骨冲洗骨髓，70 μm 细胞滤网过滤后采用红细胞裂解缓冲液（如 ACK lysis buffer，Thermo/Gibco 或同等产品）去除红细胞，PBS 或含 2% FBS 的缓冲液重悬并计数。每只受体尾静脉注射 5×10^6 个骨髓单核细胞建立全量嵌合模型（WT→Ldlr^-/-；Jak2^V617F→Ldlr^-/-）。为模拟克隆性造血（CHIP），将 20% Jak2^V617F 供体骨髓与 80% 标记骨髓（GFP 或 CD45.1/CD45.2 体系）按细胞数精确混合后移植，总细胞数保持一致。移植后 4–6 周采集外周血，采用流式细胞术检测 GFP 或 CD45.1/CD45.2 比例评估嵌合效率，并同步完成血常规检测（白细胞分类、中性粒细胞计数、血小板计数）作为 Jak2^V617F 相关血液学表型与后续分析的协变量。

动脉粥样硬化诱导与药物干预策略
在造血重建稳定后启动饮食诱导。Ldlr^-/- 受体小鼠给予西方饮食（WTD；常用配方约 21% 脂肪、0.15–0.2% 胆固醇，可选 Research Diets D12079B 或同等规格）持续 7 周以诱导粥样硬化形成；WT 受体维持普通饲料作为基础对照。实验分组包括 WT→Ldlr^-/- + WTD、Jak2^V617F→Ldlr^-/- + WTD、Jak2^V617F→Ldlr^-/- + WTD + 雷帕霉素、Jak2^V617F→Ldlr^-/- + WTD + HIF 通路干预。药物干预在 WTD 诱导 4–6 周后启动，用于评估对既有斑块进展及坏死核心扩大的影响。雷帕霉素（rapamycin/sirolimus；如 LC Laboratories 或同等来源）采用腹腔注射或饲料给药，确保稳定暴露；HIF 通路干预依据研究目的选择抑制或激活策略，可采用 HIF-1α 抑制剂（如 PX-478）或 PHD 抑制剂（如 roxadustat/FG-4592 或 enarodustat）等路径进行调控。给药过程中以体重、一般状态、血常规与肝肾功能（ALT、AST、BUN、Cr）作为毒性与耐受性监测指标，并与斑块与免疫代谢表型联动分析。

终点取材、血脂与系统性炎症指标测定
终点取材前禁食 4–6 h，麻醉后心脏穿刺采血。EDTA 抗凝血用于流式细胞术与细胞分选，血清或肝素抗凝血用于生化检测与组学分析。随后进行体循环灌流，先以 PBS 灌流充分去除血液细胞，组织学样本进一步以 4% 多聚甲醛灌注固定；用于代谢组/脂质组或蛋白/核酸提取的组织不固定、迅速冷冻保存。血脂检测采用酶法比色试剂盒测定总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）与 HDL-C（如 Wako、Cayman 或南京建成等同类商业试剂盒），必要时使用 FPLC 或超速离心评估脂蛋白分布。血浆/血清炎症因子（IL‑1β、TNF‑α、IL‑6、CXCL1/2 等）采用 ELISA 试剂盒（如 R&D Systems、eBioscience/Thermo 或同等产品）或多因子检测平台（Luminex/LEGENDplex 等）完成定量，所有样本避免反复冻融并尽量在同批次完成检测以降低批间差。

动脉粥样硬化斑块定量与组织学分析
斑块评估以主动脉根部连续切片为主，并辅以全主动脉铺片分析。取心脏连同主动脉根部组织固定后石蜡包埋，连续切片厚度 5 μm，以主动脉瓣出现作为起点，每间隔 50–80 μm 取 1 张，单只小鼠纳入 6–10 张代表性切片进行统一定量。H&E 染色用于测量总斑块面积与坏死核心面积，坏死核心定义为无核、无细胞结构的区域；胶原与纤维帽结构采用 Masson 三色染色或天狼猩红（Picrosirius Red）染色并结合偏振光或显微成像评估（可选 Sigma、Abcam 或同等染色试剂盒）。全主动脉铺片自主动脉弓至髂动脉分叉取全段纵向剪开铺展，Oil Red O 染色（Sigma 或同等产品）测定脂质沉积面积并计算斑块面积占比。所有图像采集采用统一显微镜参数，定量分析使用 ImageJ/Fiji 或等效软件，操作者在盲法编码下完成。

免疫荧光与免疫组织化学检测斑块炎症与通路活化
石蜡切片脱蜡复水后进行抗原修复，采用柠檬酸缓冲液（pH 6.0）或 EDTA 缓冲液（pH 9.0）热修复，并按抗体说明书优化条件。切片以 5% BSA 或同种血清封闭 1 h，4°C 孵育一抗过夜。巨噬细胞标志物采用 Mac-3（CD107b），中性粒细胞采用 Ly6G 与/或 MPO；mTOR 活化使用 p-S6（Ser235/236）作为读出，HIF‑1α 采用核定位与总表达联合判读；坏死与凋亡相关改变采用 TUNEL 检测试剂盒（如 Roche In Situ Cell Death Detection Kit 或同类产品）评估；铁沉积采用普鲁士蓝染色试剂盒（Prussian Blue stain kit；Sigma 或同等产品）。凋亡细胞清除相关轴采用 MerTK 抗体进行免疫荧光或免疫组化检测，若使用生物素化抗体体系，则以链霉亲和素荧光二抗或链霉亲和素‑HRP 体系完成信号放大。二抗选用 Alexa Fluor 系列荧光二抗（Thermo）或同等产品，DAPI 复染后在荧光显微镜或共聚焦显微镜采集；每批实验设置缺一抗对照、同型对照与/或 FMO 控制以验证特异性。免疫组化采用 HRP‑DAB 显色试剂盒（如 Vector Laboratories 或同等产品）检测 Mac‑3、Ly6G 与 Ter119，并以苏木素复染；结果以阳性面积占比或阳性细胞数/单位斑块面积进行量化。

主动脉弓单细胞消化与中性粒细胞分选
终点取材后分离主动脉弓并尽量剥离周围脂肪组织，剪碎后采用酶消化体系在 37°C 振荡消化约 45 min。消化体系由 Liberase（Roche）、透明质酸酶（Sigma 或同等）与 DNase I（Sigma 或同等）组成，并通过间歇轻柔吹打促进细胞释放。消化产物经 70 μm 滤网过滤并以 PBS/2%FBS 洗涤，采用活性染料（DAPI 或 Fixable viability dye，如 BioLegend Zombie 系列）排除死细胞。流式分选时首先选取 CD45^+ 免疫细胞群，再分选 Ly6G^+CD11b^+ 中性粒细胞；分选后细胞直接加入 TRIzol（Invitrogen/Thermo）或 RNA 裂解液并低温保存，用于转录组或 qPCR 检测。

流式细胞术表型、通路活化与代谢指标检测
多参数流式用于评估外周血与组织中中性粒细胞‑血小板聚集以及单核细胞亚群与血小板聚集表型。血小板标记采用 CD41/CD42b，髓系细胞与单核细胞采用 CD11b、Ly6C 等标志物分群。mTOR 活化通过胞内磷酸化蛋白染色检测 p‑S6 或 p‑4EBP1，固定透膜采用甲醇方案或磷酸化蛋白专用试剂盒（BD Phosflow 或同类产品）；HIF‑1α 采用胞内/核内染色，核内染色可使用转录因子染色缓冲体系（eBioscience Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set 或同等）。代谢与脂质相关表型包括 BODIPY 493/503 染色评估脂滴负荷（Thermo），BODIPY FL C16 评估脂肪酸摄取（Thermo），filipin 染色或 NBD‑cholesterol 评估胆固醇积累（filipin 常用于成像验证；Sigma）。功能相关表型同步检测 CD11b、脱颗粒相关分子（如 CD63/CD107a 在鼠源体系中适配抗体）等。每次流式实验设置同型对照、FMO 控制与补偿珠（BD CompBeads 或同等），并使用统一门控模板在 FlowJo 或等效软件中进行跨批次一致性分析。

中性粒细胞分离与体外功能实验
外周血或骨髓来源中性粒细胞采用 Percoll 密度梯度分离或磁珠阴性选择试剂盒（Miltenyi Biotec 或同类产品）获得高纯度细胞，分离后以流式确认 Ly6G^+CD11b^+ 纯度高于 90%，并以台盼蓝或活性染料确认存活率高于 95%。ROS 生成采用 DHR123 探针流式法（Thermo）或 luminol 化学发光法（Sigma）定量；NETs 释放采用 SYTOX Green 动态检测（Thermo）并以 CitH3 与 MPO‑DNA 免疫荧光共定位进行验证；趋化能力采用 Transwell 小室（Corning）检测，在 CXCL1/CXCL2 梯度刺激下计数迁移细胞。为验证通路‑功能耦联，在体外加入雷帕霉素或 HIF 通路调控药物进行短期处理，并同步评估代谢表型与黏附/趋化/NETs 指标的一致性变化。

活体显微镜观察中性粒细胞‑内皮相互作用
麻醉后将小鼠仰卧固定并维持体温 37°C，建立颈静脉置管用于静脉注射荧光标记抗体。注射 Ly6G、Ly6C、CD11b 等荧光抗体后，在可视化的微循环血管区域采集实时视频（例如 30 s/段），并在盲法条件下进行离线计数分析。滚动通量定义为单位时间内通过垂直于血管轴线截面的滚动细胞数；黏附细胞定义为连续 30 s 以内位置不发生明显变化的细胞数。视频采集与分析过程中统一曝光、增益与帧率等参数，保证组间可比性。

体外流动黏附实验（剪切流系统）
采用 Ibidi μ‑Slide（IV 0.1 或 VI 0.1）建立剪切流模型，通道表面以重组 ICAM‑1、VCAM‑1 与 P‑selectin 蛋白包被（R&D Systems 或同等来源），4°C 过夜后以 BSA 封闭。中性粒细胞以荧光染料或 Ly6G 抗体预标记，并在含 Ca^2+/Mg^2+ 缓冲体系中灌流以维持黏附分子活性。通过注射泵设定流速并换算剪切应力（dyn/cm²）进行报告，灌流 3 min 后以 4% PFA 固定并冲洗。随机选取多个视野采集图像，使用 ImageJ 计数单位面积黏附细胞数量。通路联动实验在灌流前对细胞加入雷帕霉素或 HIF 通路调控药物处理，以评估黏附表型的可逆性与因果关联。

中性粒细胞转录组测序与生物信息学分析
转录组样本优先选择外周血或主动脉来源分选的 Ly6G^+CD11b^+ 中性粒细胞，分选后立即 TRIzol 裂解并以柱纯化 RNA（Qiagen RNeasy Micro/Mini Kit 或同等产品），Bioanalyzer 或 TapeStation 评估 RNA 质量（RIN>7）。建库采用商业化 mRNA 或总 RNA 建库试剂盒（如 NEBNext Ultra II RNA Library Prep Kit 或同等），Illumina 平台双端测序，单样本测序深度不少于 20M reads。原始数据经 FastQC 质控后比对至参考基因组（如 STAR/HISAT2），featureCounts 计数获得表达矩阵，差异表达分析采用 DESeq2，显著性阈值设定为 FDR<0.05 且 |log2FC|≥1。通路富集采用 GO/KEGG/Reactome 与 GSEA，重点解析 mTOR 信号、HIF‑1α 靶基因集、脂肪酸代谢/胆固醇代谢及糖酵解‑氧化磷酸化平衡等与中性粒细胞免疫代谢相关的关键路径。

代谢组学与脂质组学检测
脂质组学样本包括血浆、分选中性粒细胞以及主动脉根部/斑块组织。脂质提取采用 MTBE 法或甲醇/氯仿体系，并加入覆盖 TG、CE、PC、PE、SM、Cer 等类群的内标混标；使用高分辨 LC‑MS/MS（如 Orbitrap 或 Q‑TOF 平台）进行检测。数据处理可采用 LipidSearch、Compound Discoverer 或 MZmine 等软件，按照内标与样本量（细胞数或蛋白量）进行归一化，并进行多重比较校正（FDR），通过火山图、PCA/PLS‑DA 与通路富集分析展示差异特征。代谢组学针对糖酵解与 TCA 循环关键代谢物以及脂肪酸氧化相关代谢物（如乳酸、丙酮酸、TCA 中间体、酰基肉碱谱、游离脂肪酸）进行定量，样本以甲醇/乙腈/水体系快速淬灭提取；必要时使用稳定同位素示踪（^13C‑葡萄糖或 ^13C‑棕榈酸）评估代谢通量变化，以区分“丰度差异”与“通量重编程”。

蛋白与基因表达验证（Western blot 与 qPCR）
Western blot 样本来源为分选 Ly6G^+ 中性粒细胞或主动脉组织（蛋白量不足时按组内合并）。细胞或组织采用 RIPA 裂解液加入蛋白酶/磷酸酶抑制剂裂解，BCA 蛋白定量试剂盒（Thermo Pierce 或同等）测定浓度后上样，SDS‑PAGE 电泳并转膜至 PVDF 膜。检测指标包括 mTOR 通路相关蛋白（p‑mTOR、p‑S6、p‑4EBP1）、HIF 轴蛋白（HIF‑1α）以及代谢相关蛋白（GLUT1、HK2、LDHA；脂质代谢相关 CD36、PLIN2、ACLY、ACC、FASN、CPT1A 等），内参选择 β‑actin、α‑tubulin 或 GAPDH 并在全篇保持一致。显色使用 ECL 化学发光试剂（Thermo 或同等），同批次曝光避免饱和，Image Lab 或 ImageJ 进行灰度定量。

qPCR 样本为分选中性粒细胞或主动脉 CD45^+ 免疫细胞，采用反转录试剂盒（如 Takara PrimeScript RT 或同等）合成 cDNA，SYBR Green qPCR 体系（Takara、Thermo 或同等）在标准程序下扩增，内参统一选用 β‑actin 或 Gapdh，并以 2^-ΔΔCt 进行相对定量。目标基因围绕通路与代谢模块设置，包括 Hif1a、Slc2a1、Hk2、Ldha、Vegfa 以及 Cd36、Plin2、Srebf1、Fasn、Acaca、Cpt1a、Abca1 等，并结合组学结果收敛形成核心验证面板。

炎症因子检测
细胞培养上清或血浆中 IL‑1β、TNF‑α、IL‑6、CXCL1/2、G‑CSF 等采用 ELISA 试剂盒或多因子检测平台完成定量；采集后立即分装冻存，检测时统一批次运行以减少批间差异，并记录标准曲线与质控样本结果用于质量控制。

统计学分析
样本量依据既往实验数据进行功效分析估算。数据正态性采用 Kolmogorov–Smirnov 检验评估；两组比较在符合正态分布时采用非配对 t 检验，否则采用 Mann–Whitney U 检验；多组比较采用单因素或双因素方差分析（ANOVA），并进行 Bonferroni 事后校正。相关性分析在正态分布时采用 Pearson 相关，否则采用 Spearman 相关。铁染色或 Ter119 阳性病灶等计数/比例型数据采用卡方检验。所有统计检验均为双侧检验，P<0.05 视为差异具有统计学意义。

如果你希望我进一步把“药物干预部分”写成标书里常用的完整时间轴叙述（移植第几周开始 WTD、给药持续多久、终点在哪一天），我也可以在不分条的前提下把时间线整合成一段更“可执行、可复现”的版本。