小鼠全血rRNA-dep预实验用，只看rRNA%、珠蛋白占比、文库复杂度，建议上机测多少g

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如果只是做小鼠全血 rRNA-depletion 预实验，只看 rRNA 残留比例、珠蛋白占比、文库复杂度/重复率，没必要上常规转录组深度。

我会建议 每个样本 3 G raw data 左右，作为比较合适的平衡点。PE150 的话，3 G 大约对应 1000 万 read pairs。

大致可以这样把握：

上机量 / sample	PE150 约对应	用途
1 G	330 万 pairs	rRNA%、globin% 基本够看
2 G	670 万 pairs	可以初步比较去除效果和 duplication
3 G	1000 万 pairs	推荐，预实验比较稳妥
5 G	1670 万 pairs	如果比较关心复杂度/饱和度，或者担心 rRNA、globin 特别高

其中 rRNA% 和 globin% 对测序量要求其实很低，百万级 reads 就已经比较稳定。真正把测序量往上推的是“文库复杂度”：如果想看 duplication rate、unique fragments，或者做 downsampling / complexity curve，3–5 G 会更有参考价值。

一个比较实用的方案是：直接每个样本上 3 G。如果预实验样本很少、机时不贵，也可以上 5 G/sample，然后 bioinformatics 下采样到 1 G、2 G、3 G，顺便判断这些 QC 指标在什么深度开始稳定，这样后续正式实验就很好定量。

另外提醒一点：RNA-seq 的 duplication 不能完全等同于 DNA 文库的“文库复杂度”，因为高表达转录本本身就会产生大量真实重复；小鼠全血尤其会受到 globin 高表达影响。所以预实验最好同时看 unique mapped fragments / duplication、gene body 覆盖、检测到的基因数随 reads 的饱和曲线，会比只看 duplication rate 更靠谱。

一句话：只做你说的这三个指标，我建议 3 G/sample；预算紧 2 G 也能做，想认真评估 complexity 就上 5 G。

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诺唯赞RNA建库试剂盒NR616,其中的核糖体RNA去除法，这个RNaseH 37度反应30分钟，由于反映了十几分钟PCR仪卡机了，重启后再反应十几分钟，这个时间是很严格的说超过30分钟也没关系？因为我不记得卡机之前具体反应了多久

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我先核一下 NR616 的官方说明/手册里对这一步有没有“必须严格 30 min”或允许延长的备注，再结合 RNase H 这一步的反应机理判断你这批样本该不该继续。

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Clarifying incubation limits

I’m checking the manufacturer’s protocol because the exact enzyme and step matter. I’ll distinguish a modest timing overrun from conditions that could meaningfully increase nonspecific RNA degradation.

Clarified incubation limits

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Assessing extended incubation

I’m interpreting the protocol as a 30-minute target, not an absolute cutoff. A modest overrun at 37°C is usually unlikely to ruin the sample, though longer exposure may increase off-target cleavage if imperfect RNA–DNA hybrids form.

Assessed extended incubation conditions

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判断补救方案

我倾向于认为这次不必报废：如果实际只多了十几到几十分钟，通常不会造成决定性影响。若已重新运行一段时间，就别再刻意补时；继续后续步骤，并记录这次时间偏差。

Assessed the remediation options

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你这个情况，我倾向于：继续做，不需要因为 RNase H 可能超过 30 min 就直接判废。

诺唯赞 N406 的官方流程确实规定 RNase H 消化 37℃ 30 min；你照片里也明确写了 30 min 后置冰并立即进入下一步。但我查到的官方资料里，没有给出“超过 30 min 即失败”或者允许 ±多少分钟的硬性窗口。(bio.vazyme.com bio.vazyme.com)

关键在 RNase H 的机理：它主要切的是与 DNA 探针形成 RNA:DNA hybrid 的 RNA 链，并不会像 RNase A 那样把所有游离 RNA 普遍降解。NEB 和 QIAGEN 对 RNase H 的说明也都是这一特异性。(www.neb.com www.qiagen.com) 因此，30 min 不是类似“到 31 min 就开始大规模毁 RNA”的临界点。

结合你这次的情况，我会这样判断：

如果卡机前大约已经反应了 10–20 min，重启以后又跑了 10–20 min，哪怕总有效时间实际到了 35–45 min，我认为大概率没问题，可以继续往下做。
即使实际到了 50–60 min 左右，我也不会现在把样本扔掉，尤其你这是 rRNA-dep 预实验。继续 DNase I → 磁珠纯化 → 建库 → 测序，看最终 rRNA% 才是最有价值的。
但如果你确定它在 37℃ 放了非常久，比如 1–2 h 甚至更久，那就要明显降低对这个样本作为“标准工艺验证”的信心。不是说一定失败，而是 off-target 风险和批间可比性变差了。

还有一个很重要的细节：PCR 仪“卡机”时模块温度有没有继续维持 37℃？ 如果只是界面/程序卡死，而热模块仍在 37℃，那卡机的十几分钟实际上也一直在反应；如果重启断电后模块逐渐冷却，那一段就不能简单按完整的 37℃反应时间算，但 RNase H 活性也不会在断电瞬间归零。

所以你现在既然已经“重启后又反应了十几分钟”，我建议不要再为了凑 30 min 继续延长了，直接冰上、进入 DNase I 步骤。 在总时间未知的情况下，再补时间只会增加过量反应的可能。

对你前面说的这个预实验目的——主要看 rRNA%、globin%、文库复杂度——这批其实反而可以正常留下。后面如果 rRNA 去除正常，比如达到你预期范围，说明这次时间偏差并没有实质影响；如果异常，再用一个严格 37℃ 30 min 的样本做对照即可。

简化成一句：30 min 是标准化条件，但不是“超过一点就毁样本”的硬截止线；多十几分钟我会继续做，不会重来。 (www.neb.com)

另外，你这个是小鼠全血的话，我还会特别注意一个点：如果你做的是普通 N406 rRNA depletion，它不会主动去 globin mRNA；如果你最终也要评估珠蛋白占比，N408 是 rRNA + Globin 同时去除的方案。诺唯赞官方对 N408 的描述就是针对人/小鼠/大鼠血液总 RNA，同时通过探针杂交 → RNase H → DNase I 去除 globin mRNA 和 rRNA。(bio.vazyme.com)

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