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解释这个图每个条带如何看？分别表示什么意思？为什么有input和ip两部分？

Créé le : 16 novembre 2025

Répondu en utilisant GPT-5 Thinking par Chat01

Question

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解释这个图每个条带如何看？分别表示什么意思？为什么有input和ip两部分？

Réflexion

Explaining co-IP western blot details

It seems we’re dealing with co-immunoprecipitation (co-IP) western blots. In Panels B and C, there are comparisons between Input and IP (immunoprecipitation). They’ve likely transfected Flag-PRKAR2A and HA-AKAP9 variants, with the pull-down using anti-HA antibodies in B, while anti-Flag detects PRKAR2A in both panels.

Clarifying co-IP results in Panel B

In Panel B, the 'Input' lanes show the expected anti-Flag band in Flag-PRKAR2A, with anti-HA bands in both lanes due to HA-AKAP9. The IP lanes, likely immunoprecipitated with anti-HA, show a strong anti-Flag band only in the Flag-PRKAR2A lane, indicating its interaction with HA-AKAP9. The anti-HA blot confirms HA-AKAP9 presence in the IP.

Explaining co-IP interaction in Panel C

Panel B shows that PRKAR2A interacts with HA-tagged AKAP9. Although the HA construct isn't labeled in B, it’s likely constant across lanes. In Panel C, with varying HA constructs, the anti-Flag blot confirms Flag-PRKAR2A expression. The interaction with HA-AKAP9(WT) but not Mut suggests the mutation disrupts the PRKAR2A-AKAP9 interaction.

Explaining co-IP method with band interpretation

The co-IP method uses Input to confirm expression and compare relative amounts, while IP shows immunoprecipitates. Anti-Flag and Anti-HA probe Flag-PRKAR2A and HA-AKAP9. In IP, anti-Flag shows co-precipitation if PRKAR2A interacts with HA-AKAP9. Panel C shows a weak or absent interaction in the mutant, supporting specificity.

Explaining co-IP and Blot Analysis in Chinese

  • Input vs IP: Input shows total lysate, with 10% used on average. The IP shows proteins after pull-down.
  • Anti-Flag: Detects Flag-PRKAR2A. Strong in Flag-PRKAR2A, none in Vec (indicating interaction with HA-AKAP9 in the IP).
  • Anti-HA: Shows HA-AKAP9 in both Input lanes, verifying equal expression. In IP, helps confirm successful HA pull-down.
  • Panel C: The WT shows strong interaction, while the Mut disrupts it.

Thought for 27s

Réponse

下面这张图是典型的共免疫沉淀（co-IP）+ Western。读图要点如下：

版块与探针

  • Input：上样的是全细胞裂解液的一小部分（通常5–10%）。用来证明各构建体是否表达、表达量是否接近，是“起跑线是否一致”的对照。

  • IP：上样的是免疫沉淀后的产物（用抗体把“饵”蛋白拉下来的复合物）。这里从下方“Anti-HA”能看到被拉下来的HA蛋白，说明IP使用的是抗-HA抗体，HA标记的蛋白就是“饵（bait）”；与之结合而被一并拉下来的Flag蛋白是“猎物（prey）”。

  • Anti-Flag（上方胶）：专门检测Flag标记的蛋白（这里是Flag-PRKAR2A）。

  • Anti-HA（下方胶）：专门检测HA标记的蛋白（这里是HA-AKAP9或其突变体）。

B 图（左）

  • Input/Anti-Flag：
    • Flag-Vec 无带（空载体，不表达Flag蛋白）。
    • Flag-PRKAR2A 有清晰条带（说明PRKAR2A成功表达）。
  • Input/Anti-HA：两道都有带（说明HA-AKAP9在两组中均表达，作为共同搭档存在）。
  • IP/Anti-Flag：
    • Flag-Vec 无带（阴性对照，排除非特异吸附）。
    • Flag-PRKAR2A 有带（PRKAR2A被一起拉下来，说明其与HA-AKAP9发生了结合）。
  • IP/Anti-HA：两道都有带，证明抗-HA拉下来的量相近（IP成功且回收量可比）。

结论（B）：PRKAR2A能与AKAP9发生相互作用（空载体不会被拉下）。

C 图（右）

这里固定表达Flag-PRKAR2A，改变“饵”蛋白：HA-Vec（空）、HA-AKAP9(WT)、HA-AKAP9(Mut)。

  • Input/Anti-Flag：各道都有带（PRKAR2A表达一致）。
  • Input/Anti-HA：WT与Mut有带，HA-Vec基本无带（符合构建体差异）。
  • IP/Anti-Flag：
    • HA-AKAP9(WT) 有明显带（WT能抓住PRKAR2A）。
    • HA-AKAP9(Mut) 明显减弱或没有（突变破坏/削弱了与PRKAR2A的结合）。
    • HA-Vec 无带（阴性对照）。
  • IP/Anti-HA：WT与Mut回收量相近，说明上面的差异不是因为IP量不同，而是结合能力不同。

结论（C）：AKAP9的这个突变体与PRKAR2A的结合被破坏（或显著减弱）。

为什么要分 Input 和 IP？

  • Input：证明样品表达与上样一致，排除“没表达/上样不等”的假阳性或假阴性。
  • IP：真正回答“这两个蛋白是否相互作用”的问题；只有在“饵”被拉下时，“猎物”随之出现的条带才代表特异性结合。

一句话总结：看 Input 确认“有没有、多少”；看 IP 判断“拉下来的是谁、有没有带着搭档来（是否相互作用）”。

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