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参照标书的格式，修改研究内容部分，比如说首先。采用什么构建什么模型，在此基础上检测心脏的这个指标，那个指标儿，然后怎么样的，第三通过那个检检测啥啥啥明确它的。这个转基因动物里的作用，第二呢，就是怎么研究机制。然后用那个穿小孔，或者用那个，或者是观察什么什么的中性粒细胞儿什么什么的，那些把你那个研究方法的套过去。然后实现什么目的？
参考标书：【2.1 研究内容
本课题拟通过全外显子测序技术对收集的中国人早发冠心病家系进行致病
基因与致病位点的筛选；继而对筛选获得的 AKAP9 基因 Q2136E 突变引发早发
冠心病的潜在分子机制进行系统研究；最后在早发冠心病患者中确证其在早期诊
断早发冠心病中的临床价值。
第一部分 初步发现早发冠心病的候选致病基因与致病位点
本部分将从中国人早发冠心病家系入手筛选其关键致病基因与位点。首先，
在我院就诊的早发冠心病患者中收集具有典型家族聚集特征的中国人家系，采集
外周血提取 DNA，进而采用全外显子测序技术对外显子区域进行高通量测序，
在此基础上，对测序数据进行序列比对、变异位点检测、基因分型、功能注释、
过滤筛选以及遗传解读等一系列生物信息学分析与深入挖掘，从而初步发现AKAP9 基因 Q2136E 突变可能是早发冠心病的候选致病基因与致病位点，作为
我们下一步重点研究的关键致病基因位点。
第二部分：阐释 AKAP9 基因 Q2136E 突变引发早发冠心病的潜在分子机制
首先，通过免疫共沉淀实验观察 AKAP9 与 PKA 调节亚基 PRKAR2A 相互
作用的基础上，研究 AKAP9 基因 Q2136E 突变对相互作用的影响。其次，采集
同一家系正常对照与 Q2136E 突变的早发冠心病患者外周血，分离获得外周血单
核细胞 PBMC，重编程为 iPSC，诱导分化为血管内皮细胞。继而，对血管内皮
细胞功能进行表型评估，包括细胞增殖、凋亡、迁移、血管生成以及内皮功能相
关基因与蛋白表达；采用 MSD V-PLEX 与 qPCR 等分析血管内皮细胞炎症反应
的变化；最后利用 Western blot 方法检测突变对 PKA 信号通路的影响，以及 RNA
Sequencing 寻找差异基因富集的信号通路。深入阐释 AKAP9 基因 Q2136E 突变
通过 PKA 介导的血管内皮功能受损引发早发冠心病的潜在分子机制。
第三部分：确证 AKAP9 基因 Q2136E 突变与早发冠心病发病的密切关联
本部分将采用点突变动物模型确证 AKAP9 新位点突变在早发冠心病发病中
的关键作用。利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建AKAP9
Q2136E点突变小鼠模型，
（观察冠心病发生发展），或与 ApoE
-/-小鼠构建杂交小鼠（观察冠心病加重程
度），均给予高脂高胆固醇饲料喂养 12 周，采用超声生物显微镜血流显像技术
与小动物超声成像系统评价冠状动脉血流动力学参数及心脏形态结构与心功能
改变；油红 O 染色、Masson 三色染色法、HE 染色观察主动脉斑块大小、脂质
沉积、胶原纤维以及心脏/主动脉的病理变化；联合 qPCR、Western blot、MSD
V-PLEX 与免疫荧光法检测主动脉内皮功能、炎症反应等生物学功能。确证
AKAP9 基因 Q2136E 突变与早发冠心病发病的密切关联。
第四部分：评估 AKAP9 基因 Q2136E 突变在早发冠心病早期诊断中的临床
价值
首先，在我院就诊患者中继续收集中国人早发冠心病家系或患者，扩大样本
量，以冠脉造影为金标准；继而采集外周血，提取 DNA，进行一代测序（Sanger
测序），筛查 AKAP9 基因 Q2136E 突变情况，综合分析突变阳性率，评价其作
为“中国人早发冠心病”早期诊断分子标志物的诊断能力，通过筛查识别高危人
群，实现早发冠心病的早诊早治，降低病死率。
3.1 研究方案
本课题实验方案由紧密结合、相互承接并支撑的研究组成，具体如下：
3.1.1 筛选早发冠心病的候选致病基因与致病位点
（1）研究对象
在首都医科大学附属北京安贞医院就诊的中国人早发冠心病家系，除 1 人因
急性心肌梗死去世以外，纳入研究共计 8 人，包括患者 5 人，健康对照 3 人。该
家系为非常典型的早发冠心病家系，两代人中均有早发冠心病发病，发病年龄明
显低于早发冠心病的年龄诊断标准，5 名患者中诊断为急性心肌梗死 2 人，不稳
定型心绞痛 3 人，5 名患者均接受不同次数的介入治疗或心脏搭桥手术，且排除
糖尿病、高血脂、高血压、吸烟、饮酒等传统危险因素。
入选标准：①冠心病诊断标准为至少有 1 支主要冠状动脉管径狭窄≥ 50%，
诊断为冠心病；②冠心病发生时男性低于 55 岁，女性低于 65 岁；诊断为早发冠
心病。
同一家系中未发病且无冠脉狭窄的健康成员为健康对照组。
所有入选家系成员均须签署知情同意书，本实验方案得到首都医科大学附属
北京安贞医院医学伦理委员会的批准。
（2）标本采集
符合入选标准的患者和健康对照者，抽取外周血 10 mL，并置于 EDTA 抗凝
管中，冻存于-80℃超低温冰箱。
（3）全外显子测序
DNA 提取及检测：自外周血样本提取 DNA，采用琼脂糖凝胶电泳分析 DNA
降解程度以及是否有 RNA、蛋白质污染；使用 Qubit 3.0 对 DNA 浓度进行精确
定量，其中含量在 0.6 μg 以上的 DNA 样品用来建库。
建库捕获：将基因组 DNA 经 Covaris 破碎仪随机打断成长度为 180-280bp
的片段，经末端修复和加 A 尾后在片段两端分别连接上接头制备 DNA 文库。带
有特异 index 的文库集中后与生物素标记的探针进行液相杂交，再使用带链霉素
的磁珠将基因上的外显子捕获下来，经 PCR 扩增后进行文库质检，合格即可进
行测序。
文库质量检测：文库构建完成后，先使用 Qubit 2.0 进行初步定量，随后使
用 NGS3K/Caliper 对文库的插入片段大小进行检测，符合预期后，使用 qPCR 方
法对文库的有效浓度(3 nM)进行准确定量，以保证文库质量。
上机测序：库检合格后，根据文库的有效浓度及数据产出需求，运用 Illumina
平台进行测序，所用测序模式为 PE150，即高通量双端测序，每端各测 150 bp。
（4）测序结果分析
获得原始测序序列后，在有参考序列或参考基因组(GRCh37/hg19)的情况下，
进行信息分析，包括以下三个部分：
①测序数据质量评估：对测序错误率、数据量和比对率进行统计，评估建库
测序是否达到了标准，符合标准则进行后续分析，否则需重新建库或加测。经过
去除接头及低质量 reads 进行测序数据过滤；通过 Phred 值进行测序错误率分布
检查；有效测序数据通过 Burrows-Wheeler Aligner(BWA)比对到参考基因组
（GRCh37/hg19），得到 BAM 格式的最初比对结果，然后用 SAMtools 对比对
结果进行排序，再用 Sambamba 标记重复 reads，最后利用重复标记后的比对结
果进行覆盖度、深度的统计；在测序 reads 能达到 95%以上的比对率、位点的碱
基覆盖深度达到 30X 以上时（本项目平均测序深度达到 100X），该位点处检测
出的 SNP 比较可信。
②变异检测与注释：在上述比对结果的基础上利用 GATK4 识别 SNP，InDel
以及 CNV，利用 ANNOVAR 软件对上述位点进行注释，其中包括 dbSNP 数据库、
千人基因组计划和其他已有的数据库的注释信息，注释内容涵盖变异的位置信
息，类型，保守性预测，主要步骤包括碱基质量重矫正，局部重比对以及基于单
倍型的基因分型；生成的变异位点文件进一步通过 ANNOVAR 软件进行基因组
信息以及功能注释。
③变异位点筛选：对变异检测的结果，通过基于人群频率（参考频率包括
1000 genomes，ExAC，genomAD）、变异的功能有害性预测、物种保守性分析
以及所在基因的组织表达水平进行筛选；最后对候选的变异位点结合临床表型进
行遗传解读，包括遗传位点数据库检索（数据库包括 HGMD，OMIM，ClinVar），
家系疾病共分离分析，以及 ACMG 致病性评级。初步筛选获得早发冠心病的候
选致病基因与致病位点。
3.1.2 探究 AKAP9 新位点突变引发早发冠心病的潜在分子机制
（1）观察 AKAP9 与 PKA 调节亚基的相互作用
免疫共沉淀分析：（1）将 AKAP9（2120-2700）片段和 PRKAR2A 的 CDS
区分别构建到 pcDNA3.0-HA 和 pcDNA3.0-Flag 质粒载体中。用 Lipofectamine
3000 转染试剂将 HA-AKAP9（2120-2700）和 Flag-PRKAR2A 转染至 HEK293T
细胞中，转染 48 h 后，收集细胞裂解液，采用 BCA 法测定蛋白浓度。按照 2 μg
抗体/1 mg 总蛋白加入 M2 抗体，4 ℃孵育过夜；第二天离心收集 M2 beads，洗
3 次，收集蛋白加入蛋白上样缓冲液。制备蛋白 SDS-PAGE 胶，电泳，电转，孵
育抗体，免疫印迹检测 AKAP9（2120-2700）片段和 PRKAR2A 的相互作用。（2）
将 AKAP9（2100-2700）片段中的 Q2136 位点突变为谷氨酸(E)，将 HA-AKAP9
（2120-2700）WT 和 Mut 质粒分别与 Flag-PRKAR2A 转染至 HEK293T 细胞中，
免疫共沉淀鉴定突变后的 HA-AKAP9（2120-2700）片段和 PRKAR2A 的相互作
用是否发生变化。
（2）构建 AKAP9 新位点突变的血管内皮细胞
① 外周血单核细胞（PBMC）分离：采集同一家系中正常对照与 Q2136E 突
变的早发冠心病患者外周血。将 10 mL 新鲜外周血样品与 10 mL PBS 在 50 ml
离心管内充分混匀，向离心管底部缓慢注入 10 mL 聚蔗糖。400 G 离心 30 min
后，轻轻吸走并弃去 PBS 层，收集 3 - 6 mL 白色液面。向收集到的液体中加入
PBS 至 30 mL，充分混匀后 400 G 离心 10 min，弃上清，用 1 – 2 mL IMDM 重
悬后冻存或立刻培养。
② PBMC 扩增：将冻存的 PBMC 细胞复苏后，采用红系培养基Ⅱ（红Ⅱ）
培养，按 1 x 10
7 个/孔铺 6 孔板，记为 Day -6。Day -3 和 Day -1 向 6 孔板中每
孔加 1 mL 红Ⅱ。Day -1 时用 0.1 % gelatin 处理 6 孔板，37 ℃，30 min 后，吸
走 gelatin，同时复苏 feeder 细胞，加入 MEF 培养基培养。
③ PBMC 重编程为 iPSC：Day 0 时将 feeder 细胞培养基更换为 1.5 mL 红Ⅱ。
同时将PBMC按照每个电转反应2 x 10
6个细胞分装到15 mL离心管中，1500 rpm, 5 min 离心后弃上清，用电转缓冲液轻轻重悬混匀后，加入到电转杯中，用 Lonza
电转仪，800U 程序电转。电转后的细胞悬液立即转移到 1 mL 前述准备好的含
有 feeder 和红 II 的培养皿中，混匀后置于低氧盒中，并放入培养箱中培养，
此时为 Day 0。Day 2 直接在红Ⅱ中加入 1.5 ml iPS 培养基，Day 4 弃掉上清培
养基，更换 2 ml iPS 培养基，Day 6 及以后，隔天更换 2 ml E8 培养基（含 NaB
0.25 mM 至克隆形成），充入低氧气体。电转 Day 14 后，在显微镜下挑取单个
克隆，放入含 E8 培养基的 matrigel 处理过的培养皿中，常氧状态培养 iPS 细
胞克隆。
④ 血管内皮细胞诱导分化：将 iPS 细胞克隆置于超低吸附微孔板中，采用含
胎牛血清的分化培养基培养 10 天，经内皮 VE 钙粘蛋白磁珠分选获得血管内皮
细胞。
⑤ 培养基配制：红 II：Hematopoietic Stem Cell Expansion Medium 50 ml，加
入终浓度 100 ng/mL human stem cell factor (SCF), 10 ng/mL interleukin-3 (IL-3), 2
U/mL eryrthropoietin (EPO), 20 ng/mL insulin growth factor-1 (IGF-1), 1 μM
dexamethasone, 0.2 mM 1-thioglycerol, 1x L-glutamine, 1x penicillin/streptomycin，
0.22 μm 无菌滤膜过滤；MEF 培养基：Dulbecco's Modified Eagle Medium
(DMEM) (high glucose) medium 45 ml，加入 5 ml fetal bovine serum (FBS), 1x
L-glutamine, 1x penicillin/streptomycin，0.22 μm 无菌滤膜过滤； iPS 培养基：
取 DMEM/F12 medium (Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12)
48 mL，加入 1x L-glutamine, 1x penicillin/streptomycin, 1x nonessential amino acids
solution, 终浓度 50 ng/mL fibroblast growth factor 2 (FGF2), 50 μg/mL ascorbic
acid 和 1x Insulin-transferrin-sodium selenite supplement (ITS) ，经 0.22 μm 无菌
滤膜过滤。
（3）评估 AKAP9 新位点突变对血管内皮功能的影响
将（2）诱导分化成功的血管内皮细胞，贴壁后置于 1% O2，5% CO2，94% N2
的三气细胞培养箱中进行缺氧诱导，处理时间为 24 h 或 48 h，分为四组：健康
对照组，突变组，健康对照+缺氧处理组，突变+缺氧处理组。
① SRB 法检测血管内皮细胞增殖：血管内皮细胞接种在 96 孔板中，1% O2
缺氧处理 24 h 或 48 h，使用磺基罗丹明 B（SRB）测定细胞活力即细胞增殖情
况。
② 划痕实验评估细胞迁移：细胞迁移使用伤口愈合实验检测。血管内皮细胞
在 24 孔板中生长直至融合，然后采用尖端粗细相同的无菌枪头垂直划线，用 PBS
清洗除去悬浮的细胞后，1% O2缺氧处理 24 h 或 48 h，于倒置显微镜下观察划痕
距离并每 4 小时记录 1 次图像。计算细胞迁移愈合率：迁移愈合率=细胞迁移距
离平均值/初始划痕距离均值×100%。
③ 血管生成实验：在易必迪（ibidi）血管生成玻片中进行血管生成实验。预
先将基质胶（Corning, 354277）加入孔中，待其聚合后，每孔加入 10
4个血管内
皮细胞。置于三气细胞培养箱中，1% O2缺氧处理， 24 h 或 48 h 后，使用 Nikon
Eclipse Ti with DIGITAL SIGHT DS-U3 以 4 倍放大率拍摄每个孔的图像。采用
ImageJ 测量每个图像中的血管长度。
④ 凋亡：将患者与健康对照的血管内皮细胞分别接种在 96 孔板和 6 孔板中，
贴壁后置于三气细胞培养箱中 1% O2缺氧处理，24 h 或 48 h 后用 4％多聚甲醛固
定，96 孔板用 DAPI 染色并在荧光显微镜下观察并拍照成像。6 孔板用
Annexin-V-FITC（Biolegend，640906）重悬细胞后，流式细胞仪检测细胞凋亡率。
⑤ qPCR、Western blot 检测血管内皮功能相关基因与蛋白表达：
血管内皮细胞经缺氧处理 24 h 或 48 h 以后，采用 Trizol 提取 RNA，逆转录
cDNA，qPCR 方法测定 ICAM-1、VCAM-1、E-selectin、VEGF、TXA2、eNOS
等血管内皮功能相关基因 mRNA 表达。
血管内皮细胞经缺氧处理 24 h 或 48 h 以后，采用 RIPA 细胞裂解液提取总
蛋白，BCA 法测定蛋白量，进行 Western blot，经 SDS-PAGE 电泳、电转、封闭、
抗体孵育等过程，检测 ICAM-1、VCAM-1、E-selectin、VEGF、TXA2、eNOS
等血管内皮功能相关蛋白的表达。
（4）评估 AKAP9 新位点突变对血管内皮细胞炎症反应的影响
① MSD®MULTI-SPOT 实验系统检测炎症因子
收集经缺氧处理后的血管内皮细胞上清，采用 MSD®MULTI-SPOT 系统及相
应试剂盒（V-PLEX Proinflammatory Panel1 (human) Kit），经加样、清洗、读板
检测 10 种炎症因子含量，包括 IFN-γ，IL-1β，IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12p70, IL-13, TNF-α。具体实验步骤：150 μLwash buffer 清洗 3 遍，加样 50 μL，室温震
摇 2 h，同法清洗，加 25 μL 抗体溶液，室温震摇 2 h，同法清洗，加 150 μL Read
buffer T 在 MSD 超敏多因子电化学发光分析仪进行测定，依据标曲计算炎症因
子浓度。
② qPCR 检测炎症相关基因 mRNA 的表达：收集经缺氧处理 24 h 和 48 h 的
血管内皮细胞，Trizol 提取 RNA，逆转录 cDNA，定量 PCR 测定炎症基因如
IL-1β、IL-4、IL-6、IL-17、IL-23、CXCL12、IFN-γ等炎症反应相关基因 mRNA
表达，观察炎症基因在 AKAP9 新位点突变血管内皮细胞的表达。
（5）评估 AKAP9 新位点突变对关键信号通路的影响
① Western blot 检测突变对 PKA 信号通路的影响：收集铺板于 6 cm 培养
皿，经缺氧处理 24 h 或 48 h 的患者与健康对照的血管内皮细胞，RIPA 细胞裂解
液提取细胞总蛋白，BCA 法测定蛋白量，SDS-PAGE 检测 phospho-PKA substrate
的表达，继而对下游蛋白 p38MAPK、JNK、ERK、CREB 等的磷酸化蛋白与总
蛋白的表达进行检测，进一步分析 Western blot 检测结果，对上调或下调的信号
通路有针对性地采用特异性激动剂或抑制剂处理细胞，再次进行 Western blot 检
测信号蛋白的表达情况，对调控的关键信号通路及信号蛋白进一步验证，观察
AKAP9 新位点突变对 PKA 信号通路的影响。
② RNA Sequencing 寻找差异基因富集的信号通路：患者与健康对照的血管内
皮细胞，铺板于 6 cm 培养皿，经缺氧处理 24 h 或 48 h 后，Trizol 提取总 RNA，
样品送 RNA Sequencing 检测。根据测序结果，进行聚类分析，在 DAVID 数据
库对差异基因进行 KEGG 通路富集分析、GO 功能富集分析，使用 String 数据库
对得到的差异表达基因进行蛋白质与蛋白质相互作用关系的构建，寻找差异基因
富集的信号通路。综合分析 PKA 信号通路与 RNA seq 结果，明确介导 AKAP9
基因 Q2136E 突变影响早发冠心病发病的关键信号通路。】